1. 神经科学
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季节性可塑性加巴A 信令是必需的主生物钟恢复网络中相同步

研究文章
皇冠体育电脑版 本文 皇冠体育电脑版 澳门赌场网站2019; 8:e49578 DOI: 10.7554 / elife.49578

抽象

环境中的年度变化威胁到生存,并在哺乳动物中许多生物过程通过由季节性编码核(SCN)视交叉上适应这种挑战。调谐到一天的长度根据行为,SCN与同步相位统一显示神经元节律当天都短,但会分成两个子簇长当天。 SCN的过渡状态之间是要保持季节变化的行为反应的关键,但机制调节神经可塑性ESTA的形式仍不清楚。在这里我们确定氯化物转运和加巴开关A 信令是用于SNA网络可塑性维护状态的关键。此外,我们揭示,阻断兴奋加巴A SCn的信号锁定到其漫长的一天的状态。总的来说,这些数据表明加巴那可塑性A 信号时钟使然如何神经元相互作用,以保持环境的编码。此外,该工作突出的因素可能影响易感性人类的季节性疾病。

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在冬季,随着日子越来越短,数以百万计的人发现,心情和能级他们开始下降。他们渴望碳水化合物,难以与自己的体重,并发现它很难在早晨拿到床上了。这些都是从“冬季抑郁”或季节性情感障碍(SAD)的个体,而且大多数发现自己的症状自发改善的春天增加当日子又变得更长。从明亮的光疗法也有许多好处在冬季,但不是每个人都完全因子效应对这种治疗,所以需要额外的选项。

冬季抑郁时出现大脑调整到在一天的长度变化随着冬季的到来。负责作出调整大脑区域是视交叉上核ESTA(SCN)。该SCN是大脑坐标身体的那昼夜节律的主时钟 - 等东西的食欲,体温,睡眠和清醒的日常波动。

但是,以及作为大脑的时钟(SCN)是大脑的日历也。在冬天,天都短。当SCN神经元对她们的运动量并同步协调火灾。但在夏天,天都长在SCN神经元分成不同的时间,这火两簇。通过这两种状态之间转换,在SCN帮助身体调整到一天的长度季节性变化。 ROHR,Pancholi等的。通过显示灯改变了SCN的神经化学现在提供了新的洞察背后ESTA过程的机制。

暴露小鼠长天导致从抑制在SCN神经元激活它们叫做加巴到开关大脑化学物质。 ESTA从抑制到激活堵塞开关锁定SCN到其“夏天状态”。 ROHR,Pancholi等的。这ESTA提出故障状态过渡到冬天可能是一个有趣的方式,以防止冬季抑郁。

同时,仍有许多需要学习这个过程,铺平道路,这些研究结果为更好地了解冬季抑郁症以及如何最好地对待它的神经生物学。

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介绍

由系统生成的日常生理节律有助于预测由地球自转造成的环境变化(小屋和beersma,2011; Pittendrigh,1960年皇冠体育电脑版的莫霍克等人,2012)。所述SCN本身是时钟小区的网络进行交互的彼此电路调节突发性质,处理光的线索,并提供每天信号到下游组织(埃文斯2016; 黑斯廷斯等人的,2018)。在细胞水平上,SCN神经元显示约在电节律和分子活动24小时(黑斯廷斯等人的,2018皇冠体育电脑版Buhr的和高桥,2013),以及调节细胞生理学的时钟控制的基因(Zhang等人,2014)。 ,虽然分子昼夜节律蜂窝时钟驱动器,其中神经元的scn间相互作用同步,放大和稳定细胞网络内的节奏(埃文斯2016; 黑斯廷斯等人的,2018)。此外,SCN调整到环境,24小时有效地匹配太阳活动周期的时期,本地时区的阶段,当时的日长的波形,因为它在今年改变了。因此,SNA网络作为时钟和年度每天都日历,并通过SCN神经元相互作用是至关重要的理解行为和生理的时间定义调节电路级机制。

环境中的季节变化威胁到生存和幸福的生活在这个星球上的生物。为了应对这种挑战,许多生物过程的调节季节性的基础上。 ,虽然日常报时是蜂窝属性,季节性编码经由在SCN时钟细胞的时空关系(变化有成就Meijer等的,2010; 埃文斯和戈尔曼2016)。当白天短,SCN神经元形成蜂窝时钟随着表达和电活动蛋白质的类似每日倍的高度同步的人口。与此相反,当白天长时,SNA网络切换到由时钟神经元两个子群集,在反相位周期(为特征的一个备用状态Evans等的。,2013; 稻垣等人的,2007)。网络编码的scn季节的能力,对于大量的各种生物过程,包括复制,免疫功能,代谢的调节是至关重要的。在人类中,同样地影响季节性广泛的功能:如睡眠,代谢和神经传递(garbazza和贝内代蒂,2018),它可以在人的3-10%,每年产生病理复发(WEHR等人的,2001; 路易等人的,2006)。 ,虽然季节性情感障碍是密切相关的生物钟的功能透光调制(wirz正义,2018),调节至一天的长度灵敏度的机制仍然不明确。

是通过SCN神经元中表达的主要神经递质加巴(阿尔伯斯等人的,2017年),以及最近的工作指示SCN网络(那天长度调制加巴信号Evans等的。,2013; 明等的,2015年; farajnia等的。,2014)。典型地,尽管GABA是作为分类的抑制性神经递质,所述加巴A 杂五聚体受体是配体门控离子通道可渗透氯化物和碳酸氢盐即能引发超极化或去极化要么根据氯离子的电化学梯度(皇冠体育电脑版)。在成熟的神经元,细胞内氯化物水平由CL调节- KCC2挤出机(K+ CL- 共转运蛋白2)和CL- 进口商NKCC1(NA+ K+ CL- 共转运1)。在这两个氯化物共转运蛋白的相对表达和/或功能的改变导致离子可塑性:短期和长期神经调制变更该响应加巴A 信令(皇冠体育电脑版)。神经可塑性ESTA最有据可查的例子期间发生发展(Rivera等的,1999)当NKCC1驱动器在未成熟的神经元的去极化逆转氯化物的潜力,但上调KCC2的导致切换到成年期的超极化GABA应答。然而,这个过程不是不可变的;随着成熟神经元KCC2的下调使得切换到兴奋加巴A 在成年脑中不同的电路几个信令(忠,2012; 休伊特等人的,2009; Lee等的,2011; Ostroumov等人去了。2016; Sarkar等的,2011)。在SCN,最近的工作表明暴露于长天,增加神经元的数量作出回应,以加巴随着去极化(farajnia等的。,2014)而升高细胞内氯化物(明等的,2015年)。进一步,在改建加巴A 随着信令相关行为昼夜节律的变化(明等的,2015年; farajnia等的。,2014; 杜瑞秋等人的,2015年),和加巴的作用A 在神经元中的信令取决于SCN季节性状态耦合(Evans等的。,2013)。集体,这项工作表明,加巴A 皇冠体育电脑版

在这里,我们提供洞察机制中加巴的功能意义和季节可塑性A SCN网络中的信令。首先,我们展示如何在一天的长度分子调制响应时钟GABA SCN刺激的变化。接下来,我们提供洞察机制加巴季节可塑性的A 通过证明在特定表达SCN,其处理箱灯长天KCC2减少该信令。最后,我们测试的光周期变化中的氯离子转运和加巴的功能意义A SCN信令网络动态。我们的研究结果表明,在加巴季节性开关A 皇冠体育电脑版A 主站的时钟电路用于保持在一天的长度变化的敏感性。

结果

在SCN时钟的加巴刺激调节日子长分子响应

要更深入地了解在加巴季节变化的功能后果A 信令,我们首先测试了如何天长度调制SCN时钟对GABA的分子响应。以前的工作已经预测季节性开关兴奋加巴A 信令将改变SCN时钟如何是滋补加巴刺激复位(杜瑞秋等人的,2015年)。测试此预测,我们检测了使用作为SCN分子时钟的读出在加巴诱导PER2光周期变化:: luc的复位节奏。 mPer2LUC 小鼠被暴露于每天(L12)或长日,每天(L20)20小时的光的光12小时要么至少8周。从小鼠SCN切片收集各光周期下饲养,和PER2 :: LUC节律三个周期治疗200微米加巴任一者或车辆(之前在体外进行了监测图1,图1的补充)。加巴未洗出下面的应用程序,以提供补品的刺激,并且其浓度稳定在培养24小时的至少(图1,图1的补充)。在以前的工作(Evans等的。,2013),该SCN时钟转移到以后的阶段是加巴当的PER2 :: LUC节奏槽(施加于L12片图1,图1的补充)。重要的是,这个响应被阻止通过重置加巴A 受体拮抗剂荷包牡丹碱(图1,图1的补充),与先前的研究一致表明GABA诱导即通过重置加巴介导的A 信令和不加巴B 信令(刘和里珀特,2000)。

无论我们研究未来漫长的日子SCN由次跨越重置昼夜周期测量到加巴应答反应(改变图1a)。在L12切片,加巴PER2 :: LUC移动节奏以依赖于相位的方式,引起在早期阶段的延迟和相位超前主观夜晚期间的昼夜周期的其他时间(图1A-1C)。值得注意的是,相ESTA复位即节律的形状类似于先前报道的用于电节律的解离中的神经元SCN 加巴诱导的相移(刘和里珀特,2000皇冠体育电脑版图1A-1C)。这些结果表明,加巴诱导的节律的波形由复位光周期改变,通过无论是相位响应曲线(如所示图1a)或极坐标图(图1b)。在另一方面,整天曝光并没有改变重置系统地这个剂量加巴的幅度(皇冠体育电脑版)或载体(图1,图1的补充),它从NMDA的光周期抑制(区分它图1,图1的补充)和光致复位(Pittendrigh等的,1984; VanderLeest等人的,2009皇冠体育电脑版A 信令调制SCN分子时钟的固有响应(杜瑞秋等人的,2015年皇冠体育电脑版Pittendrigh等的,1984; VanderLeest等人的,2009)。

长天改变分子SCN响应加巴。

(A)的相位响应曲线加巴是通过光周期的历史改变。该说明双数据绘制说明响应跨越昼夜周期,双标绘斜体的时间点。周围点画线表示平均零响应于车辆的脉冲(也见 图1,图1的补充)。沿着横坐标绿色和白色条代表相对于PER2 :: LUC节奏(绿色阴影)的峰值时间的加巴按昼夜时间。代表PER2 :: LUC节奏的痕迹,请参阅 图1,图1的补充。 (B)极坐标图表示这时光周期改变加巴复位响应节奏的波形。 (C) Data binned for statistical analyses. n = 15–21 (CT0), 6–8 (CT6), 13–14 (CT12), and 6–8 (CT18) SCN slices/photoperiod. * Differs from L12 control, post-hoc Least Square Means contrasts, p<0.01. n.s.: phase with non-significant resetting relative to vehicle controls. See 补充文件1 完全统计结果。

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消除长天SCN在KCC2 / NKCC1节奏

接下来我们测试的细胞机制,它可能改变SNA网络的加巴反应。增加长天NKCC1相对于基因的编码SCN KCC2(明等的,2015年),但是切换到兴奋性加巴A 在成人脑中的其他神经回路信令由KCC2的通常的翻译后下调(从动忠,2012; 休伊特等人的,2009; Lee等的,2011; Ostroumov等人去了。2016; Sarkar等的,2011)。一天的长度到测试如何在蛋白质氯化物水平调制共转运蛋白表达,我们测量KCC2和NKCC1在SCN切片L12和L20在跨越光的时间点从小鼠中收集:暗周期。基于以前的报告记录在大鼠SCN区域响应加巴和氯化物共转运表达的差异(Belenky等人的,2010; 黄鳝等人的,2005),我们分析NKCC1 KCC2并分别在SCN网络的两个主要细分(即,芯和壳; 亚伯拉罕和Moore,2001年)用精氨酸加压素(AVP)划定表达SCN壳(图2a, 皇冠体育电脑版)。最后,我们使用KCC2 / NKCC1表达的正式比率分析(图2b)鉴于相对共转运蛋白表达影响细胞内的氯离子浓度(皇冠体育电脑版; Lee等的,2011)。重要的是,KCC2和NKCC1免疫细胞趋势与以前的研究相一致(皇冠体育电脑版),随着KCC2免疫反应性局限于等离子体很大程度上膜和NKCC1免疫反应在这两种膜和细胞质明显的(皇冠体育电脑版)。

消除KCC2 / NKCC1表达长天区特有的节奏。

(A)代表性图像表示AVP,KCC2,NKCC1在关灯的时间(时间授时12 ZT12)的L12 SCN。蓝色和用于合并图像区域的橙色圆圈表示分别的scn壳和核的分析。 (B)成比例的图像示出了变化KCC2 /在KCC2 / L20 NKCC1节奏在小鼠的小鼠和损耗L12 NKCC1表达。比例尺= 50微米。 (C)KCC2的表达每日/ NKCC1是在芯SCN节奏L12下,L20而不是下(N = 4-5只小鼠/时间点/光照期)。 (D)光周期在SCN和KCC2 NKCC1表达的调节。 (E-F) L20 reduces daily mean KCC2 expression in the SCN core and increases daily mean NKCC1 expression in the SCN shell. # significant rhythm, CircWave cosinor test, p<0.05, n.s. not rhythmic. * Differs from L12 control, post-hoc Least Square Means contrasts, p<0.01 (color-coded for 氯化物 co-transporter in 2D)。 See 补充文件1 完全统计结果。

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第一,我们已审查L12下氯化物共转运蛋白表达由于存在对在鼠SCN时空图案稀少信息。 L12下,KCC2 / NKCC1波动在一天(图2B-C)在接收室具体SCN致密视网膜神经支配(亚伯拉罕和Moore,2001年)。具体而言,KCC2 / NKCC1在SCN芯改变(图2c, Circwave cosinor rhythmicity test: p<0.05), but not in the SCN shell (图2c, Circwave cosinor rhythmicity test: p>0.5) due to region-specific expression of both 氯化物 co-transporters (图2d, 皇冠体育电脑版)。第一对KCC2,表达在AVP +区域比在非PRS表达不仅SCN的区域低,但同样的儿子和PVN(皇冠体育电脑版)随着大鼠一贯的工作(Belenky等人的,2010; HAAM等的,2012)。 In the SCN, KCC2 expression was 91-fold lower in the AVP+ shell versus the non-AVP-expressing core (Student’s t: p<0.005), but KCC2 levels did not vary over the day in either region (图2d, Circwave cosinor rhythmicity test: p>0.2)。 In contrast, NKCC1 expression fluctuated over the day in both SCN compartments (图2d, Circwave cosinor rhythmicity test: p<0.005 for each region), which is associated with daily KCC2/NKCC1 fluctuations in the SCN core (图2c)。这些结果证明KCC2和NKCC1在SCN在标准光照条件下,时空的方式,这可能有助于在时钟和加巴区域神经元兴奋性的差异调节A 回应(阿尔伯斯等人的,2017年; 黄鳝等人的,2005; 克莱特和艾伦,2017年; 在Choi等人,2008)。

值得注意的是,L20消除KCC2 / NKCC1的每日节律在SCN芯(图2B-C, Circwave cosinor rhythmicity test: p>0.4) by decreasing the mean daily expression of KCC2 (图2D-E, LSM contrasts: p<0.01)。 Also in the SCN core, L20 attenuated the daily rhythm in NKCC1 expression (图2d,Circwave余弦节律检验:p = 0.1),但不改变整个一天ITS水平(图2F, LSM contrasts: p>0.8) or at individual time points (图2d,全因子ANOVA:p值= 0.09)。 SCN在壳,L20 NKCC1增加的表达(图2F, LSM contrasts: p<0.01) and disrupted the daily rhythm of NKCC1 (Circwave cosinor rhythmicity test: p>0.1) due to elevation at specific times of the light:dark cycle (图2d, LSM contrasts: p<0.01)。 This produced a slight decrease in overall KCC2/NKCC1 levels (L20: 14.83/124.61 = 0.12, L12: 13.16/93.97 = 0.14) but did not markedly alter daily expression of KCC2/NKCC1 in the SCN shell (图2c)。这些结果表明,双向调节表达氯化物共转运体的长天在SCN,与在芯减少KCC2 SCN,在SCN NKCC1增加壳,和消除在NKCC1两个隔室的节奏。给定的小的变化氯化物即共转运蛋白表达可以改变氯化物的电化学梯度(皇冠体育电脑版; 伍丁等人的,2003)这些变化将是集体的预计将增加在每个隔间中SCN去极化反应,GABA的概率。这与以前的工作相一致表明长天能升高细胞内氯化物,去极化氯平衡电位,并提高SCN神经元兴奋性反应的数量表现出加巴(明等的,2015年; farajnia等的。,2014)。

在NKCC1 KCC2功能光周期变化和确定SCN耦合的动态

皇冠体育电脑版HAAM等的,2012; 在Choi等人,2008)。对网络编码的氯化物转运的测试效果,SCN切片从L12和L20的小鼠中收集,然后培养随着NKCC1拮抗剂布美他尼(BU,80微米)时,KCC2拮抗剂vu0240551(VU,80微米),或媒介物处理的介质。在L12切片,我们发现,无论是BU和VU SCN 0.35小时的时间内(增加图3-图1的补充),其阻断共培养与加巴A 皇冠体育电脑版图3-图1的补充)。重要的是,结果表明这些抑制KCC2和NKCC1的通过改变SCN 加巴调节的分子时钟的功能A 信令,这与以前的工作表明这些化合物改变的氯离子转运,神经元兴奋性,和加巴诱发钙反应(一致farajnia等的。,2014; HAAM等的,2012; deisz等的。,2014)。在细胞水平上,或BU VU都增加壳和核SCN神经元的切片L12的期间(图3-图1的补充),但并没有显着改变SCN组织(图3-图1的补充)或蜂窝节律的阻尼(图3-图1的补充)。这些数据表明,网络和细胞的功能是不会受到药物治疗的影响。

与以前的研究相一致(Evans等的。,2013),在体内暴露于L20通过强加的壳和芯之间有大相位差SCN在体外对第一周期(重组了SCN图3a)。 ESTA相位差减小过在载体处理的切片时间(图3a),其是由河豚毒素敏感的信令机制(驱动Evans等的。,2013)。量化网络恢复的动态过程,我们测定了在SCN壳和核的神经元过度体外时间的相位关系变化(图3b皇冠体育电脑版Hansel等的,1995),细胞应答的大小和方向在所述芯 - 壳依靠在关系的开始记录(图3b)。具体而言,壳芯相位差在“负”方向SCN减少当相位核神经元由2-6小时导致SCN壳神经元(图3b),而它在相对的“正”方向SCN减小当相位核神经元由8-16小时导致SCN壳神经元(图3b)。蜂窝周期指示ESTA的分析这是通过在蜂窝很大程度上节律SCN神经元芯,一个较长时期通过了的当网络中的负方向重新同步响应耦合的变化(从动图3c, 图4-图1的补充)和较短的周期当再同步发生在相反的方向(图3c, 图4-图1的补充)。在SCN壳神经元调制周期被较少受到相位关系影响(图3c, 图4-图1的补充),这表明特定的神经元亚群埃斯塔那没有车辆的条件下多移动。总体而言,这些结果表明,从STI整编在SCN网络状态恢复体外细胞间主要由于调制相位信号该SCN芯和神经元的周期(图3D)。

从由于细胞间的信号诱导L20改组状态SNA网络恢复到改变的相位和SCN神经元核心的那一段。

(A)复合相映射示出在体外的前五个周期在媒介物处理的切片从L20的小鼠SCN收集在壳芯相位差的减小。 (B)在赋形剂处理的切片耦合响应SCN从L20的小鼠中收集,如量化由壳芯相位差(随着时间的推移在体外(N = 35个L20切片的变化在ψ变化),见 图4-图1的补充 皇冠体育电脑版CSCN核和壳神经元)的细胞应答期间耦合网络。 (D)极坐标图描绘期间,在正向和负向连接蜂窝网络的响应。见 补充文件2 皇冠体育电脑版

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皇冠体育电脑版图4a, 图4-图1的补充皇冠体育电脑版图4a-b中, 图4-图1的补充)由于SCN核心期神经元的反应改变(图4c-d, 图4-图1的补充)。与此相反,NKCC1的抑制减慢卜恢复网络(图4a-b中, 图4-图1的补充)通过影响壳和核的神经元SCN的周期(图4c-d, 图4-图1的补充)。有趣的是,BU阻塞SCN芯期间神经元的响应当网络显着由L20改组(图4-图1的补充),与该区域的ESTA ESTA KCC2减少光照下(这是一致的图2d)。统称为数据表明,在KCC2 / NKCC1活动这些光周期变化确定通过调节加巴速率和网络恢复动态A SCN核心信号。

KCC2和NKCC1网络动态影响SCN期间耦合。

(A皇冠体育电脑版 图4-图1的补充 为细胞样品尺寸)。 (B)平均相位映射描绘在体外药物诱导的效果示出在耦合的网络的幅度和方向上周期2(C2 SCN时空组织)和周期5(C5)。 (C)平均周期映射示出对细胞周期特定区域的影响。 (D)平均周期长度(±SCN壳和核车辆提供神经元,VU,Bu或clp290处理,而在通过重新组织L20(即,核 - 壳关系= -11±2小时小时诱导的状态)的SEM)。见 图4-图1的补充 for full period response curves. Below X-axis: Schematic illustrating how network 耦合 is altered by region-specific modulation of period responses, with the net effect on the direction of network re同步 indicated within each polar plot. * Differs from Vehicle control, post-hoc Least Square Means contrasts, p<0.01 (color-coded by antagonist in 4A), + Differs from within-group complementary region, LSM contrasts, p<0.05. See 补充文件2 完全统计结果。在其他公约 图3.

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为了进一步减少测试KCC2在调节L20之后耦合网络的作用,我们切片处理随着KCC2 SCN clp290激活剂(Gagnon等的,2013)。 clp290是氨基甲酸酯前药KCC2增加表面表达,细胞内你减少氯离子,和还原 E加巴 与减少在成熟的神经元表达KCC2(Ostroumov等人去了。2016; Gagnon等的,2013; 菲利尼等的,2017年; Chen等人,2017年)。基于氯离子流量的比例模型,提高预测会模仿NKCC1拮抗剂的作用KCC2结果和SCN同样缓慢复苏。是否功能测试KCC2恢复会产生不利影响SCN耦合,L12和L20我们收治100微米片clp290,如 Chen等的。 (2017)。并且类似于VU BU,clp290通过在壳和核的神经元都延长期间(增加的L12 SCN片期间图3-图1的补充),但并没有明显再改变网络组织(图3-图1的补充)随着时间的推移或细胞在体外阻尼(图3-图1的补充)。有了一致的预测,clp290在L20片衰减恢复网络(图4a-b中)由于在SCN核心和壳的神经元偶联反应的废除(图4c-d, 图3-图1的补充)。总体而言,clp290的L20片效果那些是喜欢定性BU诱导(图4E),提供了互补的证据表明,在KCC2介导的氯化物转运的光周期减少是细胞间耦合网络中的关键调节剂在从一天状态恢复。

NKCC1调制从体内长天网络恢复

鉴于BU延迟恢复网络体外,接下来我们测试是否有利于调节体内生理同样的行为。布美他尼是FDA批准的利尿在人类和啮齿类动物模型中使用,它具有-被证明影响神经功能,当口服给药(tyzio等的。,2014)。来测试昼夜行为BU的影响,L12和L20的小鼠单独圈养在车轮运行的笼中,并提供蒲式耳(5毫克/公斤)或载体中的饮用水。在饮用水施用后,BU浓度在血浆中达到500微米,下丘脑中的40纳米,后者的其中半数最大途径BU的浓度为抑制NKCC1(罗素2000)。 8周光周期的预处理有或没有BU之后,L12和L20的小鼠被释放到恒定黑暗(DD, 图5a, 皇冠体育电脑版)为了监测SCN耦合的昼夜行为反射的变化(埃文斯和戈尔曼2016; Pittendrigh和大安,1976a)。具体地讲,暴露于长天涂改在夜间啮齿类动物的昼夜波形通过压缩活性相,这是由解压缩释放到DD确认后的持续时间。重要的是,每日节律的波形随着SCN状态(变化,活性相的解压缩为SCN舱单返回到其同步状态是密切相关Evans等的。,2013; Margraf等人的,1991; Jagota等人的,2000)。还长天缩短自由运行期,但ESTA后劲SCN组织后仍继续在体内已经恢复(Evans等的。,2013; 明等的,2015年; 皇冠体育电脑版)。

在光周期NKCC1变化释放到恒定黑暗(DD)之后调节体内昼夜可塑性。

(A皇冠体育电脑版 皇冠体育电脑版 actograms额外的代表。 (B)光周期,但不BU,影响活性光夹带在持续时间(N = 6只小鼠/光周期/处理)。 (C) BU influenced plasticity in circadian waveform after release from L20 into DD by slowing the expansion of activity duration. * Differs from photoperiod-matched vehicle control, LSM contrasts, p<0.05. See 补充文件1 完全统计结果。

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与体外获得一致的结果,BU速度减慢昼夜波形的恢复释放后从L20到DD体内(图5a-C, 皇冠体育电脑版). L20 mice treated with BU displayed slower recovery of circadian waveform over time in DD due to decreased rate of activity decompression (Repeated Measures ANOVA: Drug*Time p<0.05), but BU did not significantly alter behavior after release from L12 (Repeated Measures ANOVA: Drug*Time p>0.5)。 Further, BU did not alter wheel running rhythms under entrained conditions, (图5b, Repeated Measures ANOVA: p>0.5), SCN organization, body weight, water intake, activity levels, free-running period, phase angle of entrainment, or behavioral adjustment to simulated jetlag (皇冠体育电脑版)。结果ESTA模式表明在NKCC1的相对角色的光周期变化,从接触到长天调节将行为恢复率。

兴奋加巴A 信令需要SCN相同步的恢复

皇冠体育电脑版A 皇冠体育电脑版休伊特等人的,2009; Lee等的,2011; Ostroumov等人去了。2016; Sarkar等的,2011),我们假设非经典回应GABA(即,去极化)调节暴露于长天之后的scn耦合动力学。去极化响应加巴通过移位在氯化物的阴离子梯度磁通驱动和碳酸氢盐两者(皇冠体育电脑版; Rivera等的,2005),和碳酸氢盐再生是必要的兴奋加巴A 回应(Ostroumov等人去了。2016; 皇冠体育电脑版)。因此,如果我们预测从L20该SCN恢复需要兴奋加巴A 反应,然后再同步网络将被衰减时再生是通过碳酸氢碳酸酐酶抑制拮抗剂,乙酰唑胺(Ostroumov等人去了。2016; 皇冠体育电脑版)。拒绝治疗乙酰唑胺喝水小鼠,因此,我们回到了我们的体外实验实时SCN耦合跟踪。

SCN slices from L12 and L20 mice were cultured with either acetazolamide (ACE, 100 μM)或载体(<0.1% DMSO)。 Similar to VU, BU, and CLP290, ACE increased L12 SCN period in a 加巴A皇冠体育电脑版图6-图1的补充)。还通过消除L12 Ace在片芯和壳SCN神经元之间的周期差SCN增加具体地说SCN神经元壳的周期(图6-图1的补充皇冠体育电脑版图2c)。有趣的是,细胞周期的均衡在L12减小壳芯相位差,通常在舱单体外时间片(图6-图1的补充)或者释放到DD后(Evans等的。,2013; 埃文斯等人的,2011)。这表明兴奋ESTA加巴A 在神经元中SCN壳信令强加壳芯相位差,先前的工作中使用与非选择性抑制剂呋氯化物转运一致(明等的,2015年)。

由于L20在SCN核心KCC2下降,我们预测,将发挥更加显着的ACE在这种情况下的效果。值得注意的是,治疗的王牌锁定在改组后的L20状态的SNA网络(图6A-B)通过阻断具体地说期间SCN神经元核的响应(图6C-d, 图6-图1的补充皇冠体育电脑版图2e)和响应能力增加蒲式耳(图4-图1的补充)适用于SCN这种特殊的隔间。类似于由氯离子转运抑制产生的效果,ACE的影响是区域专用和状态依赖性因为神经元的耦合壳SCN反应并不改变当网络是在重新组织状态(图6-图1的补充)。总的来说,这些数据揭示了光周期即开关加巴A 必需的信令是SNA网络和核心SCN的功能恢复神经元的响应由在加巴的MOST这些光周期变化的影响A 信号。

不规范的加巴A 皇冠体育电脑版

(A)平均相位映射用于治疗使用ACE或媒介物处理的介质L20切片。 (B)王牌衰减SCN耦合重组后的网络响应由L20(L20王牌N = 16片,见 图6-图1的补充 为细胞样品尺寸)。 (C)王牌延长响应SCN核心网络的神经元由L20(即,核 - 壳关系= -11±2小时小时重组后的期间,见 图6-图1的补充 期间为全响应曲线)。 (D) Schematic illustrating effects of ACE on cellular period and 耦合 response in the polarized SCN state induced by L20. * Differs from vehicle control, LSM contrasts, p<0.05. See 补充文件2 完全统计结果。在其他公约 图4.

//doi.org/10.7554/elife.49578.015

讨论

最突出的是用于SNA网络光线索,并且在透光条件的季节变化经由SCN蜂窝时钟的时空关系(编码Meijer等的,2010; 埃文斯和戈尔曼2016)。由于光的环境的不断变化的性质,对维护SCN编码的可塑性的溢价。我们通过揭示光周期这里提供新的洞察季节性编码开关加巴A 信令是必要的恢复功能之后它被SCN由光中断。通过检查细胞的动态变化同步,我们发现了在加巴那可塑性A 信令是一个关键neuroadaptation修饰SCN生物钟神经元彼此沟通,如何去规范电路功能根据一个不断变化的环境。与KCC2开关对应ESTA下调在特定隔室SCN接收和处理输入的光,这是在L20切片的相同区域显示改变的细胞应答氯化物的药理学调节在运输期间和非经典的加巴A 信号。总的来说,这些结果指明KCC2的即下调在该特定区域是为这一过程可能是由类似的机制驱动,以调节这些加巴暴露于长天后网络恢复和ESTA临界A 其他在信令网控制行为很重要。

在这里,我们发现加巴季节性变化A 所述SCN网络中的信令规范过渡回其同步状态。以这种方式,在季节性加巴可塑性A 可被视为信号稳态机制,因为它充当它是由光扰动之后恢复功能电路。稳态不处于上下文昼夜通常使用的一个术语,但季节性其适用于编码并非没有先例。例如,正式试验表明,在行为和生理恢复到稳定状态的长一天,光周期调整时的刺激中去除体内(Pittendrigh和大安,1976a)。进一步,SCN光周期的改变在蜂窝关系体内DD释放和离体培养物(后返回到稳定状态Evans等的。,2013)。稳态重新校准是大多数生物系统的关键,但潜在的机制仍然在许多神经网络知之甚少是困难的,因为电路过渡到实时的研究。通过体外这种动态跟踪过程中,我们首先证明了加巴意想不到的作用A 在网络恢复信令(Evans等的。,2013)。在这里,我们展示这种形式的神经可塑性的要求不规范的加巴A 由通过调制SCN神经元核的耦合响应展示SNA网络锁定到ITS改组状态王牌信令。有趣的是,我们的数据表明,非规范的加巴A 也通过作用于不同的细胞靶标信令稳态下调制SCN动力学。具体而言,ACE影响在L12由于SCN壳神经元的分子时钟的调制切片蜂窝关系。 ESTA在舱单整个蜂窝网络周期和壳芯减毒相位差均衡随时间即培养物或释放到体内后DD(Evans等的。,2013; 埃文斯等人的,2011)。 ESTA表明,非规范的加巴A 信令作用通过调制SCN神经元的外壳期间施加的差异在稳态阶段,但是在偏振状态功能有助于同步通过作用于芯SCN神经元。最近的报告表明加巴A 信令在其他类型的直接审查这里没有网络行为(涉及在Freeman等人,2013; ‧赫兹等人的,2017年皇冠体育电脑版阿尔伯斯等人的,2017年)。

除了提供新颖的洞察的加巴的季节变化的功能意义A 信令,本发明的结果扩大理解细胞机制底层神经可塑性的ESTA形式的。对加巴神经元的反应A 信令由KCC2和NKCC1表达的比率的影响,并改变在共转运要么离子通量可以反转因为对于氯化平衡电位接近静息膜电位(皇冠体育电脑版; 伍丁等人的,2003)。在其他成年网络,KCC2下调是调制符号加巴的关键事件A 因为它改变了信令协同转运比取悦NKCC1介导的CL- 皇冠体育电脑版休伊特等人的,2009; Lee等的,2011; Ostroumov等人去了。2016; Sarkar等的,2011)。在这里,我们表明减少KCC2长天在SCN核心,在SCN壳增加NKCC1,以前的工作表现出一致的与长天增加去极化反应,加巴 SCN两个隔间(farajnia等的。,2014)。给定来自单独表达得出推论的限制,我们接着测试使用两种不同的方法在KCC2 / NKCC1光周期变化的功能implicaciones(即,布美他尼随着NKCC1拮抗作用,激动随着clp290 KCC2)。这两种药物衰减的长日照SCN网络的返回到基态的离体STI在一个定性类似的方式的能力,这表明氯离子转运的光周期调整用于速度恢复SCN破碎后通过光。值得注意的是,长天减少KCC2核心SCN白天,哪个阶段SCN何时加巴神经元的反应是最被光照受影响(相匹配farajnia等的。,2014)。进一步体外,KCC2 SCN加速复苏的拮抗作用,通过改变SCN神经元的核心的偶合反应,提示KCC2进一步抑制这超出了光可能具有潜在的优势体现活动。最后,我们发现通过调节神经元SCN核心的具体耦合响应该ACE阻塞网络恢复。这些结果的收敛性质是随着化合物对这些的氯离子转运,神经元兴奋性,和加巴诱发钙反应的已知作用(一致farajnia等的。,2014; HAAM等的,2012; deisz等的。,2014)。总的来说,这些结果表明,在SCN芯KCC2下调是在主时钟的临界蜂窝网络适配驱动恢复。目前还不清楚如何KCC2光调制的表达,但它是可能的变化是光周期ESTA翻译后通过蛋白质表达和/或活性调节实现,因为长天不增加 KCC2 转录(明等的,2015年)。事实上,KCC2功能可以通过磷酸化状态及其控制(皇冠体育电脑版皇冠体育电脑版阿尔伯斯等人的,2017年)。由于是KCC2在车厢下调SCN接收和处理光的输入,识别特定的途径由压抑光KCC2在此区域代表了今后工作的一个重要领域。

与体外其一贯的影响,我们发现在体内布美他尼降低昼夜可塑性。 ,虽然系统性方法用在这里并没有针对特定位点,布美他尼昼夜下降波形的具体可塑性,艺术这是由SNA网络紧密相连,时空编码属性(埃文斯和戈尔曼2016; Pittendrigh和大安,1976a; Margraf等人的,1991; VanderLeest等人的,2007)。行为状态的布美他尼在全身给药后恢复较慢是一样生活恢复SCN在体外降低的速率。相反,住在布美他尼政府没有阻止整天本身或编码后劲上自由运行周期,这可能反映府的那脑水平不足以阻止这些效果。在目前的研究布美他尼的下丘脑水平走近半最大抑制浓度为NKCC1(罗素2000; 罗旭德等人的,2013; Hampel等的,2018)。全身性施用的布美他尼已-被证明在调节疾病的小鼠模型中海马突触可塑性和存储器(Marguet等人的,2015年; Deidda等人的,2015年), and the efficacy of this compound in previous and current work may relate to its prolonged administration over many days to mice, a species in which the plasma half-life of bumetanide is >45 min (特普费尔等人去了。2014年)。鉴于调节这两个SCN昼夜周期和波形,今后的工作中针对特定位点ESTA可以提供额外的洞察过程控制编码和季节性的后遗症。药理操作,虽然月被需要持续的药效在几周没有日常干扰的限制,目前的结果可以被用来开发和优化遗传方法来调节的氯离子转运和/或加巴A 具体的scn在神经元的信令。目前的结果表明,小区标识和相位可能是在这些未来的研究设计的重要考虑因素。

在协议以前的工作表明随着变化加巴日常SCNA 对应随着NKCC1信令改变的表达(Belenky等人的,2010; 在Choi等人,2008皇冠体育电脑版A 皇冠体育电脑版阿尔伯斯等人的,2017年)。在这里描述的区域KCC2 / NKCC1表达的差异在跨SCN车厢都KCC2和NKCC1表达体现差异。 AVP +类似于下丘脑中的其他结构(HAAM等的,2012),我们检测KCC2斯塔克区域横跨SCN壳和核中表达的差异。另外,峰表达NKCC1的出现定时跨SCN隔室不同,其中在小鼠SCN在一天中的两次(传导NKCC1的Western印迹分析一致在Choi等人,2008)。有趣的是,低NKCC1在SCN芯对应于低细胞内氯化物中的特定区域中的相位(表达杜瑞秋等人的,2015年)。因此,在氯乙烯共转运蛋白表达的日变化可能有助于在记录和加巴区域神经元兴奋性的差异A SCN神经元的反应(阿尔伯斯等人的,2017年; 黄鳝等人的,2005; 克莱特和艾伦,2017年; 在Choi等人,2008)。考虑到KCC2改变了NKCC1会影响和无数其他细胞procesos(皇冠体育电脑版),进一步调查他们对SNA网络中的作用是必要的。

在SCN电路季节变化改变到当前GABA刺激分子反应。这里引起复位相位响应与该主音刺激加巴位移的相位有效SCn的分子时钟的一致的发现(杜瑞秋等人的,2015年)。一个警告长期治疗是额外的目标无意的调节。考虑到这一点,值得注意的是,治疗加巴目前进补的反应中那些由急性治疗更引发类似的几个方面出现(刘和里珀特,2000)。例如,加巴诱发的复位被遮挡加巴A 拮抗作用,复制以前的工作直接排除在外的加巴的贡献B 信令(刘和里珀特,2000)。另外,它已经-发现了类似的大小的加巴引导学生相移的1个小时和6小时脉冲(刘和里珀特,2000),这表明SCN响应不复位根本上长期治疗改变。有了这个想法一致,加巴引起复位的波形显示的L12 SCN这引起在片重复以前的工作(刘和里珀特,2000)。 ,虽然绝对值和重置响应的所需的相位不同研究变化,ESTA其它重要的方法学可以反映差异(例如,经由PER2 :: luc的相位与电节律[刘和里珀特,2000],从小鼠成年SCN切片与来自出生后早期SCN幼仔分离神经元[刘和里珀特,2000皇冠体育电脑版‧赫兹等人的,2017年)。进一步的研究,如这些结果可提供额外的洞察加巴这些电路的季节可塑性以及如何相交随着生物钟细胞内。

最后,目前的全年业绩可能对人类健康和生理的变化影响。季节性失调表现在人们的3-10%,以最大的发病率在高纬度地区出现的光周期的季节性变化在哪里发音MOST(wirz正义,2018)。证据支持用于季节性基于光的,昼夜基础(WEHR等人的,2001; wirz正义,2018),但在季节性病症人类灵敏度变化的神经生物学基础仍然是未知的。和人类一样,是由两个季节性特点变种很多啮齿类动物:短日照反应者和无反应者短天(尼尔森,1987年)。西伯利亚仓鼠,用于询问光周期的电路的经典模型,季节性显示器典型地变动中繁殖,代谢,免疫功能,情感状态,与认知(高盛,1999年皇冠体育电脑版Margraf等人的,1991; Puchalski和林奇,1991年; Goldman等的,2000)。它已经-被推理短天无反应反映了SCN的个体差异,阻碍耦合网络的可塑性。在这里我们说明,加巴A 调节季节性可塑性信令SNA网络的状态,提高的可能性,在SCN加巴个体差异可有助于电路在响应自然的季节性变化。因此,机制调节光周期因素与SCN可能有助于加巴电路的改造,以更好地作进一步的调查了解,每年反复出现的疾病的神经基础。

材料和方法

关键资源表
试剂类型
(种)或
资源
指定源或参考身份标识额外
信息
遗传试剂(米首页鼠)mPer2LUC老鼠Yoo等的,2004rrid: imsr_jax:006852
抗体抗PRS(豚鼠多克隆)半岛实验室
猫#T-5048
rrid: ab_2313978一抗,
(1:1K)
抗体抗NKCC1(多克隆山羊)Abcam公司
皇冠体育电脑版
rrid:ab_10675276一抗,
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抗体抗KCC2(兔多克隆)微孔
猫#07-432
rrid:ab_310611一抗,
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抗体抗豚鼠,Alexa氟647杰克逊免疫
猫#706-605-148
rrid:皇冠体育电脑版二级抗体,
(1:200)
抗体驴抗山羊Alexa氟555Abcam公司
猫#ab150130
rrid:ab_10894526二级抗体,
(1:200)
抗体驴抗兔Alexa Fluor488的杰克逊免疫
猫#711-545-152
rrid:ab_10893040二级抗体,
(1:200)
商业分析或试剂盒布美他尼ELISA试剂盒公司的Neogen猫#103719-1

会展和饲养条件

请求详细的协议

涉及所有小鼠进行了程序根据NIH指南护理和使用动物并通过机构动物照顾及使用委员会在马凯特大学获得批准。纯合子mPer2LUC 老鼠 (Yoo等的,2004)中饲养和下标准升高至24小时光照:黑暗周期随着12小时光照和12个小时黑暗(LD12:12点关灯:1800厘沲)。在10-12周龄,雄性mPer2LUC 与小鼠单独地坐落每天光照12小时(L12,关灯1800厘沲)或每天的光20小时(L20,关灯:1800厘沲)最少8周。环境室温的温度保持在实验条件和两种菌落下22±2 C C,和小鼠具有 AB不限量 获得水和食物(Teklad啮齿类动物食物#8604)。

SCN收集和离体测定相位重

请求详细的协议

冠状切片SCN(150微米)来自mPer2累计LUC 小鼠和如所描述的培养以前(Evans等的。,2013)。简单地说,SCN切片4-6小时前收集关灯,因为夹层在后期主观一天不显着重置SCN的相位(Davidson等的,2009)。各物的scn在含有补充了0.1毫米甲虫萤光素,0.02%B271.2毫升空气缓冲的Dulbecco氏改良的外植体培养基(DMEM,西格玛d2902)的(GIBCO 17504),一个盘容器上的膜插入物培养0.01%HEPES(Gibco公司15630) ,0.005%纳乔3 (GIBCO 25080),0.004%右旋糖(Sigma公司g7021),和0.01%青霉素/链霉素(GIBCO 15140)。用于复位的实验中,PER2 :: LUC节律进行了监测Actimetrics光度计使用培养箱容纳在37℃至集。有时跨越昼夜周期,GABA(200微米)或DMEM的等效体积后体外3天加入培养基中。方向和复位响应的大小通过测量峰PER2对周期预测的和实际时间:: LUC表达的差异以下药物/车辆应用使用软件(Actimetrics)为lumicycle量化分析。衍生化的GABA浓度随在培养时间进行定量使用耦合到荧光检测高效液相色谱法(HPLC)。简要地,媒体样本200倍稀释用在2-巯基乙醇的存在下,使用Shimadzu VP LC10AD自动进样器的HPLC级水之前phthalaldehdye柱前衍生化邻至(OPA)。和100mm磷酸氢二钠的流动相为,0.1mM的EDTA,和10%乙腈(6.04 pH值);色谱分离是使用Kinetex XB C-18(50 PHENOMENEX×4.6毫米,2.6微米)实现。使用Shimadzu荧光检测器10RF-AXL分别为320的激发波长和发射和400nm,加巴检测。

免疫组化

请求详细的协议

物大脑八个时间点跨越昼夜周期(N = 4 /时间点/光周期),并且蛋白表达在收集自由浮动切片使用具有三重先前描述的方法免疫组织化学(评价Evans等的,2015年)。简要地,SCN切片(40微米)在次洗涤6 PBS,在阻断正常驴血清,并温育48小时,在4℃下用初级抗体PRS(1:1K,Peninsula实验室,目录#T-5048,rrid : ab_2313978),NKCC1(1:500,Abcam公司公司,目录号ab99558,rrid:ab_10675276皇冠体育电脑版ab_310611)。下列初级抗体孵育,SCN洗涤六次在PBS片,在室温下与第二抗体(1孵育2小时:500每一个用于:rrid:ab_10893040皇冠体育电脑版ab_10894526,Alexa氟555; rrid:皇冠体育电脑版,Alexa氟647),在PBS中洗涤6次,然后一个安装到使用抗褪色ProMount金试剂显微镜载玻片上。得到的荧光图像与使用相同的设置对于所有样品的Nikon共聚焦显微镜A1R +。是ImageJ中分析的图像。使用免疫PRS,选择感兴趣的(投资回报)​​区为每个切片通过SCN配售在PRS +背内侧壳和相同的尺寸和形状的在腹侧PRS-负芯的第二ROI循环投资回报率。酰氯计算共转运蛋白表达,ROI被转移到每个KCC2和NKCC1用于阈值化背景减除图像。对于每个样品,将KCC2 / NKCC1比跨越计算和两个瓣的scn平均。获得相似的结果与自由形式的ROI SCN包围每个隔室,但是这种方法被丢弃因为在SCN AVP表达升高和变化的岩心样品在更多。最后,每个平均每日共转运氯化物表达通过在累计不同时间点塌陷所有样品从数据计算。

PER2 :: LUC成像和分析

请求详细的协议

SCN PER2 :: luc的节奏进行成像在作为 Evans等的。 (2013). Briefly, PER2::LUC was collected using a Stanford Photonics CCD camera within a light-tight incubator set to 37°C. For drug treatments, pharmacological agents were added at the start of the experiment directly to the culture medium (always <0.05% total volume of medium) and remained for the duration of the recording. SCN slices were treated with the NKCC1 antagonist Bumetanide (80 μM, BU), the KCC2 antagonist VU0240551 (80 μM, VU), the KCC2 agonist CLP290 (100 μM), the carbonic anhydrase antagonist Acetazolamide (ACE, 100 μM), or vehicle (DMEM with DMSO <0.1%)。 To maintain drug efficacy for long-term recordings in this interface-culture preparation, drug concentration was increased slightly relative to previous work employing bath application of drugs for short-term electrophysiological recordings (i.e., 50 μM BU [在Choi等人,2008],75微米VU [HAAM等的,2012],50微米王牌[Ostroumov等人去了。2016])。评估在整个SCN的节奏,对于整个SCN的时间系列被使用ImageJ提取药物治疗的效果分析了lumicycle分析和软件。

分析SCN功能在网络和细胞水平,使用基于MATLAB的计算分析如先前所述(Evans等的。,2013; 埃文斯等人的,2011)。简单地说,用于使用具有2像素间距,其中,所述线性趋势被消除和巴特沃斯滤波器应用于以除去高和低频率干扰均匀网格的图像ROI直径的每个12像素产生一个时间序列。相复合,以产生映射示出了用于整个组的结果,将样品通过最小化对齐到相同的x-y坐标的24小时求和生物发光型材平方差的总和。评估对细胞的节奏,迭代过程是采用背景扣除后和局部噪声来定位和提取物从细胞样罗伊斯数据。到测量相互作用壳和核在SCN神经元,我们计算峰值之间的相位差PER2 :: LUC在SCN芯罗伊斯和SCN的平均峰值时间壳罗伊斯超过2-4个周期在体外,在如 Evans等的。 (2013)。超过体外时刻的相位关系的变化来定量耦合响应的大小和方向。蜂窝时期是峰 - 峰值计算为在体外相同的时间间隔的平均周期的长度。为响应这两个耦合和期间,相对峰值时间被确定为从互补细胞类型的两个峰时间减去每个单元的峰值时间平均周期。

昼夜行为分析

请求详细的协议

用于体内药物治疗,小鼠接受布美他尼(BU,5毫克/公斤)或载体(DMSO)在其饮用水中,持续8周光夹带(L12 L20或)和5周持续黑暗(DD)中的。是血浆及下丘脑布美他尼的水平与布美他尼ELISA试剂盒(的Neogen公司,猫#103719-1)制造商的说明根据测试。药物浓度用的VersaMax酶标仪(Molecular Devices)上,并与标准曲线来评价的。 ASSESS布美他尼对昼夜行为的影响的,运动每日节律经由车轮运行的笼中,并在ClockLab采集系统(Actimetrics,Evanston的,IL)进行监测。 CLockLab使用软件(Actimetrics,Evanston的,IL),发病活性,偏移活动,活动持续时间,和车轮转数的每一天的数目的时间测定的实验。发病活动的时间在30分钟内同样地在阈值以上的至少两个更多个箱上面的15个计数,由不活动的至少6小时之前和之后的阈值每个区间识别为第一天通过。活性通过一个类似地确定到规则但相反的抵消。发病和偏移活动的时间之间的差来计算活动持续时间。自由运行周期是从回归线拟合活性的斜率测量声母超过在DD四周。通过6小时黑暗周期:最后,对行为时差综合征BU的作用在小鼠中的一个子集评定由前进突然L12的光。重新夹带的速率进行定量通过计算每个鼠标变换活性发病所需要的天数由6小时,在该点的活性节律重新对准到新LD周期。

统计分析

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皇冠体育电脑版奥斯特等人的,2006)。使用所生成的相位,耦合和周期响应曲线4小时运行平均值,那么一个折叠成用于统计分析时间仓。全因子ANOVA用于评价光周期和昼夜节律时间的效果(或药物状态或细胞类型),以及两个主要变量之间的相互作用。事后两两比较采用最小二乘均值对比,以正确的首页庭明智的错误执行。随着时间的推移和行为的变化及其昼夜光照带和药物相互作用条件进行分析利用全因子ANOVA重复测量,然后事后最小二乘均值对比。统计显着性在所有情况下设置在P≤0.05。

引用

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    演化时间保持机制:提早出苗和适应光照
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    皇首页学会学报B的哲学交易:生物科学 366:2141年至2154年。
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决定书

  1. 莱斯利·格里菲斯ç
    回顾编辑;布兰代斯大学,美国
  2. 埃弗·马德
    高级编辑;布兰代斯大学,美国

在透明度,澳门赌场网站,出版了最实质审查请求,并伴随着作者的答复。

感谢您的文章提交“加巴A季节性可塑性信令阶段是必要的主生物钟恢复网络中同步”审议通过 澳门赌场网站。您的文章,由二审稿审查,评估已通过格里菲斯去过莱斯利监督作为审查主编夏娃黄鼠狼的高级编辑。该评论者的选择保持匿名。

评论首页都彼此讨论的回顾和检讨编辑起草这一决定,以帮助您准备一份修改稿。

摘要:

ESTA纸地址如何在光线有趣的变化,因为在好发季节,影响SCN的问题。该作者发现在一个可逆的方式改变曝光加巴响应为“长天”的光照条件。这些变化在切片恢复到基线从动物到夏天改编条件,这是相关的随着CL的变化- 梯度。工作有多么SNA网络的耦合是按季节时间尺度调控具有重要意义。

必要的修改:

尽管已评审的积极性,在审阅过几次关切的数据和统计分析,限制了数据的可解释性的呈现。这些都与分析,从而不应该需要新的实验所有问题。

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2)采用KCC2 / NKCC1表达的基于荧光IHC的比率是有问题的。虽然作者是小心,不要过度解读的结果的文本这些数据和确认IHC定量限制的讨论中,数据是代表图2的方式仍然是误导(即在巴图的颜色标签图2b)。原稿将由完全除去KCC2 / NKCC1比和着眼于原料得到很大的提高不是为每一个转运单独值。与另外的问题是比分析所呈现的数据不是对数标度,和对数转化的数据的余弦分析运行,因为地板效应很可能躲在KCC2 /节奏L12 NKCC1比在壳。此外,三色梯度由于应该是网络规模的差异结束上使用的是难以分辨。

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4)写作:在一般原稿写得;然而,写作是更好地有人在外地认识和处理存在的顾虑昼夜场外的读者不会理解或掌握的调查结果。引进应该更简洁,更快速地突显在文献中的差距。因为就目前的句子描述在实验室的前期工作(Evans等的。,2013)。在这样旁边就像在过去的开头段的句子引入声音的最后一段:“这些结果揭示了......”和增量贡献的声音。另外,作者应该使用更多的具体条款和避免使用行话。

//doi.org/10.7554/elife.49578.022

笔者响应

必要的修改:

尽管已评审的积极性,在审阅过几次关切的数据和统计分析,限制了数据的可解释性的呈现。这些都与分析,从而不应该需要新的实验所有问题。

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我们已经包括对于所有的响应曲线(即,x轴表下面嵌入在图4a,图6B,以及图4-图补充1)的统计分析,并且我们已经加入补充文件在充分的统计报告。在图4-图订正补充1中,我们包括所有时间二进制数由每个细胞类型划分的样本大小。

2)采用KCC2 / NKCC1表达的基于荧光IHC的比率是有问题的。虽然作者是小心,不要过度解读的结果的文本这些数据和确认IHC定量限制的讨论中,数据是代表图2的方式仍然是误导(即在巴图的颜色标签图2b)。原稿将由完全除去KCC2 / NKCC1比和着眼于原料得到很大的提高不是为每一个转运单独值。与另外的问题是比分析所呈现的数据不是对数标度,和对数转化的数据的余弦分析运行,因为地板效应很可能躲在KCC2 /节奏L12 NKCC1比在壳。此外,三色梯度由于应该是网络规模的差异结束上使用的是难以分辨。

我们已经搬进了KCC2和NKCC1表达的原始数据到主图2我们有没有修订色阶的比例图像的要求。以更好地可视化的L12 SCN壳缺乏节奏,我们有我们绘制的数据放到不同规模ESTA舱。从这个修订数字,很显然,地板效果不模糊在此区域内KCC2 / NKCC1节奏。我们有保留的数据,因为比这些蛋白质一起被称为调节氯离子流量,和我们的预测是基于比率测量模型。

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In the revised manuscript, we have included analyses of vehicle responses, which do not differ by time of treatment or photoperiod (图1,图1的补充, Full Factorial ANOVA, p > 0.4)。 As requested, data in 图2d and 2E are now analyzed with Full Factorial ANOVA, followed by paired Least Square Means contrasts – this has not changed our conclusions for this dataset. As requested, data in 图5b-C have been analyzed with Full Factorial Repeated Measures – this has not changed our conclusions for this dataset. We have removed reference to the ANOVA omnibus test, described our statistical tests in greater detail in the 材料和方法, clarified how we corrected for family wise error, added Supplementary files 1 and 2 with full statistical statements, and specified sample sizes for all response curves.

4)写作:在一般原稿写得;然而,写作是更好地有人在外地认识和处理存在的顾虑昼夜场外的读者不会理解或掌握的调查结果。引进应该更简洁,更快速地突显在文献中的差距。因为就目前的句子描述在实验室的前期工作(Evans等的。,2013)。在这样旁边就像在过去的开头段的句子引入声音的最后一段:“这些结果揭示了......”和增量贡献的声音。另外,作者应该使用更多的具体条款和避免使用行话。

难道我们调整了我们介绍的要求。

//doi.org/10.7554/elife.49578.023

文章和作者信息

作者详细信息

  1. 凯拉和罗尔

    生物医学科学,马凯特大学,密尔沃基,美国系
    贡献
    正式的分析,调查,方法,写作,审查和编辑
    同样与贡献
    Harshida Pancholi
    利益争夺
    没有利益冲突的声明
  2. Harshida Pancholi

    生物医学科学,马凯特大学,密尔沃基,美国系
    贡献
    正式的分析,调查,方法,写作,审查和编辑
    同样与贡献
    凯拉和罗尔
    利益争夺
    没有利益冲突的声明
  3. 煞笔海德尔

    生物医学科学,马凯特大学,密尔沃基,美国系
    贡献
    正式的分析,调查,书面审查和编辑
    利益争夺
    没有利益冲突的声明
  4. 克里斯托弗的Karow

    生物医学科学,马凯特大学,密尔沃基,美国系
    贡献
    正式的分析,调查,书面审查和编辑
    利益争夺
    没有利益冲突的声明
  5. 大卫MODERT

    生物医学科学,马凯特大学,密尔沃基,美国系
    贡献
    正式的分析,调查,书面审查和编辑
    利益争夺
    没有利益冲突的声明
  6. 尼古拉斯ĴRaddatz

    生物医学科学,马凯特大学,密尔沃基,美国系
    贡献
    正式的分析,调查,方法,写作,审查和编辑
    利益争夺
    没有利益冲突的声明
  7. 珍妮弗·伊文思

    生物医学科学,马凯特大学,密尔沃基,美国系
    贡献
    皇冠体育电脑版
    函授
    jennifer.evans@marquette.edu
    利益争夺
    没有利益冲突的声明
    ORCID icon “这orcid ID标识这篇文章的作者:” 0000-0002-6220-0273

资金

美国国立卫生研究院(r01ns091234)

  • 珍妮弗·伊文思

白厅基金(2014-12-65)

  • 珍妮弗·伊文思

该资助者在研究设计,数据收集和解释,或提交作品出版的决定没有任何作用。

确认

我们要感谢斯坦福大学光子学和阿德里亚诺dellapolla技术援助。来自美国国立卫生研究院(r01ns091234)和白厅基金(2014-12-65)这项工作的支持资金。

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动物实验:在严格按照指南中的建议为美国国立卫生研究院的实验动物护理和使用进行了这项研究。是所有的动物办理了按照批准机构动物护理和马凯特大学使用委员会(IACUC)协议(#AR-282)。

高级编辑

  1. 黄鼠狼前夕,布兰代斯大学,美国

编辑审查

  1. 莱斯利·格里菲斯C,布兰代斯大学,美国

出版历史

  1. 收稿日期:2019年6月22日
  2. 修:2019 10月15日,
  3. 皇冠体育电脑版 二○一九年十一月二十零日(版本1)

版权

©2019年,罗尔等人的。

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