1. 神经科学
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A 果蝇 神经元蜡样脂褐质的模型 cln4 揭示的功能机制hypermorphic增益

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引用 本文 如: 澳门赌场网站2019; 8:e46607 DOI: 10.7554 / elife.46607

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常染色体显性遗传神经元蜡样lipofusc在oses(NCL) cln4 通过在突触小泡(SV)蛋白CSPα突变引起。我们开发的动物模型 cln4 通过表达 cln4 突变人cspα(hCSPα)在 果蝇 神经元。类似的病人, cln4 突变诱导hCSPα和过早杀伤力的过度低聚以剂量依赖的方式。而不是局限于SVS,最 cln4 突变体hCSPα异常积累,并与泛素化蛋白和prelysosomal标记小时,LAMP1共定位。超微结构检查发现轴突和神经元胞体异常频繁的膜结构。通过诱导杀伤力,低聚和prelysosomal积累 cln4 突变通过减少内源野生型(wt)DCSP水平衰减,并且通过增加重量的水平提高。此外,减少HSC70的基因剂量也衰减 cln4 表型。综合考虑,我们建议 cln4 等位基因类似驱动过度齐聚和损害膜运输功能的突变的主导hypermorphic增益。

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介绍

NCLS包括一组渐进的神经变性疾病的有14个与疾病相关的基因的已知被称为 cln1-14 (Haltia,2003; 澳门新葡亰平台游戏app下载 ; jalanko和braulke,2009年; 摩尔和Cotman,2015年)。有NCLS大多是症状性婴儿或幼年起病和视力丧失,步态异常,癫痫,痴呆和过早死亡的特点。在一般NCLS被认为是脂褐质由于积累溶酶体贮积病和由功能突变的隐性损耗通常会导致有一个例外, cln4。因此,溶酶体功能障碍,失调ER-溶酶体运输,或血脂异常的修改被认为是大多数NCLS的基础上,结合已知突变基因的功能(一致贝内特和rakheja,2013; 监狱Trullols等的,2015年; 摩尔和Cotman,2015年; 瓦里亚等人的,2013)。疾病的机制了解你,以及更多流行的疾病NCLS implicaciones因为突变越来越多的 CLN 也基因引起其它类似疾病变性,进行性癫痫智力低下随着,脊髓小脑性共济失调,色素性视网膜炎,小脑共济失调少年,或帕金森病9(额颞叶澳门新葡亰平台游戏app下载 ; 摩尔和Cotman,2015年; Yu等人,2010)。

澳门新葡亰平台游戏app下载 cln4 有25和46岁之间的成年发病。 cln4 由氨基酸无论是(AA)或取代l115r在SVl116δCSPα蛋白单个氨基酸缺失,由哪一个编码引起的是人 dnajc5 基因(贝尼特斯等人的,2011; 卡迪厄二酮等的,2013; 所述Nosková等人,2011; 沃立诺夫等人的,2012)。 CSPα功能是唯一的NCL-相关基因其中,因为它编码蛋白质SV没有已知溶酶体相关。因此,不存在 cln4 溶酶体模型解释失败。

CSPα是进化保守的神经保护和HSC70突触功能的共伴侣需要保持及防止神经变性(伯戈因和摩根,2011; 伯戈因和摩根,2015年; z在smaier,2010)。在果蝇和小鼠的基因缺失导致进行运动缺陷,过早死亡和麻痹由于神经变性(Ch和ra等的,2005; 费尔南德斯 - 查孔等人的,2004; 乌姆巴赫等人的,1994; z在smaier,2010; z在smaier等的,1994)。上SVS,分子伴侣形式CSPα配合物与用于HSC70选定的一组客户端,其中包括蛋白质和dynam在上圈套(的Ch和ra等的,2005; 聂等人的,1999; Sharma等的,2012; Sharma等的,2011; Zhang等人,2012)。维护和功能的动力素诱捕很可能关键QS的神经保护作用(伯戈因和摩根,2011; 罗萨斯等的,2012; Sharma等的,2012; Sharma等的,2011)。

cln4 造成l115r和l116δ显性突变是在棕榈酰化半胱氨酸字符串(CS)cspα,介导CSPα的分泌贩卖轴突末端,ITS SV关联的领域,它的二聚簇(阿诺德等人的,2004; 张伯伦和伯戈因,1998年; 油渣和张伯伦,2006年; 澳门新葡亰平台游戏app下载 ; 大山等人的,2007; 斯托尔斯和Isacoff,2007年; 澳门新葡亰平台游戏app下载 )。 CS域的棕榈启用CSPα的从内质网和高尔基的出口(张伯伦和伯戈因,1998年; 油渣和张伯伦,2006年; 澳门新葡亰平台游戏app下载 ; 大山等人的,2007; 斯托尔斯和Isacoff,2007年)。然后棕榈酰化必须维持CSPα与突触小泡前体(的SVP)和/或SVS,关联推测是由于对棕榈酰化的短寿命(Fukata和Fukata,2010)。后者已被指明由突触棕榈酰转移hip14 / dhhc17的功能突变的损失QS的大大减少突触水平(大山等人的,2007; 斯托尔斯和Isacoff,2007年澳门新葡亰平台游戏app下载 Sambri等人的,2017年)。由于MPS-IIIA小鼠cspα的过表达(e)中改善它们的突触前的缺陷,神经变性,和存活时间延长,CSPα可能是许多溶酶体疾病的发展的关键因素(Sambri等人的,2017年)。

尸检分析 cln4 这表明,占主导地位的患者的大脑 cln4 突变有两个关键病理作用:减少脂质化cspα单体的水平,并促进高分子量蛋白质聚集体CSPα/低聚物的形成被泛素化也就是说(油渣等的,2012; 亨德森等人去了。2016; 所述Nosková等人,2011)。在HEK293T看到了突变的类似效应,PC12细胞,并自成纤维细胞 cln4 澳门新葡亰平台游戏app下载 贝尼特斯和金沙,2017年; 油渣等的,2012; 张和Ch和ra 2014)。在体外, cln4 CSPα突变形式的聚集体以时间,浓度和温度依赖性(张和Ch和ra 2014)。 CSPα的棕榈酰化促进聚合(油渣等的,2012),虽然它不是必需的(张和Ch和ra 2014)。此外,死后的大脑 cln4 患者表现出蛋白质棕榈酰化的大规模变化(亨德森等人去了。2016)。 cln4 突变有HSC70包括的ATP酶活性的体外活化短期CSPα的共同伴侣功能无不良影响,或结合伴侣客户喜欢SNAP25和发动蛋白(张和Ch和ra 2014)。然而,长时间的培养过程中,突变CSPα刺激HSC70的ATP酶活性的能力显着下降(张和Ch和ra 2014)。

多种机制 cln4诱导神经退行性疾病已建议。与其他神经退行性疾病,为的主导性质突变CSPα可单独账户的逐步聚集 cln4 澳门新葡亰平台游戏app下载 油渣等的,2012; 亨德森等人去了。2016; 所述Nosková等人,2011; Zhang等人,2012)。反过来,ESTA可逐渐耗尽各级CSPα,使得它会导致单倍体 - 不足触发神经退行性疾病(油渣等的,2012; 所述Nosková等人,2011; 张和Ch和ra 2014)。这种可能性一致,一岁大的杂合子小鼠CSPαKO制定一个适中的发动机是由缺陷的特征在于减少发动机单元维持在招聘过程中反复刺激(能力洛佩斯·奥尔特加等人的,2017年澳门新葡亰平台游戏app下载 油渣等的,2012; 亨德森等人去了。2016; Zhang等人,2012)。然而,之间的联系 cln4 澳门新葡亰平台游戏app下载 cln4 疾病。

在这里,我们产生了两个 果蝇 模型 cln4 无论是通过表达 cln4 hCSPα在苍蝇的神经元突变或直流正接。人性化的飞行模型的优点是能够以可视化差异的独特优势 cln4 hCSPα突变体和野生型直流正接。我们展示我们飞这两款机型复制的致病所有关键的生化特性 cln4, 包括水平降低适量单体,高分子量水平增加,和泛素化的适量的低聚物。进一步分析揭示新的见解潜在机制 cln4 病理。

结果

澳门新葡亰平台游戏app下载 果蝇cln4 模型

我们产生了 果蝇 模型 cln4 通过表达人类疾病的致病蛋白质hcspα-l115r,hCSPα-l116δ(图1a; L116 L115,从现在起被表示为)和控制correspondiente重量从酵母GAL4控制-UAS表达系统的转录插入在一个共同的基因组phi31-attP位点hCSPα(品牌和Perrimon,1993年)。除非另有说明,我们使用了泛神经元ELAV C155-GAL4驱动程序(林和Goodman,1994年)为了表达这些蛋白质在独占否则重量神经元(w1118)。

澳门新葡亰平台游戏app下载 果蝇cln4 模型。

(A)适量和的位置的结构 cln4 突变hCSPα和直流正接的半胱氨酸字符串(CS)域。适量的N-末端结构域Ĵ,接头结构域和C-末端表示。 (B)从单个转基因随着免疫染色hcspα和内源性DCSP一个ELAV驱动表达在神经元重量hCSPα动物幼体VNC。比例尺,20微米。 (C澳门新葡亰平台游戏app下载 D澳门新葡亰平台游戏app下载 直流正接X1 / +,黑色), CSPX1 / R1 缺失突变体(绿色)和 CSPX1 / R1 突变体表达WThcspα(蓝色),HCSP-L115,(橙色),hCSPα-L116(红色),或直流正接2(紫色)与ELAV驱动程序。

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澳门新葡亰平台游戏app下载 澳门新葡亰平台游戏app下载 2A; 图1-图1A补充)。高效表达neuronallyhCSPα被投放到轴突,并在直流正接内源性共定位随着腹神经索幼虫(VNC的神经纤维网; 澳门新葡亰平台游戏app下载 )和幼虫神经肌肉接头(NMJs; 图1c)。与hcspα贩卖一致的标准,多数neuronally表达hCSPα的被棕榈酰化,这是通过处理幼虫的蛋白质提取物用0.5M羟胺(确认图1-图1A补充)。

cln4 突变引起的神经元的hCSPα剂量依赖性低聚。

野生型和突变hCSPα(L115 / L116)被表达在神经元幼虫 白色1118 动物(对照)与来自一个或两个的转基因(2个)的ELAV驱动程序。 (A)西方探查hcspα幼虫脑蛋白提取物的印迹。对于耐hCSPα低聚物SDS信号(OM),脂化的单体HCSP(LM),以及非脂化HCSP(NLM)表示。 β微管蛋白用作上样对照。 (B)探查hcspα或Western印迹赖氨酸连接从指示的基因型成人头提取泛素的hCSPα免疫沉淀。的IgG重链的信号表示。 (C)平均低聚物/单体比率(N = 5)。 (d-f的)的脂化水平(D),非脂化(E),总hCSPα(F)归一化到hCSPα重量(N = 6)。 (克-i的hCSPα低聚物)的剂量依赖性增加(G),脂质化(H),和非脂化的单体水平(I)。归一化至负载控制和标绘为从重量hCSPα(N = 6)的一个拷贝表达正倍数变化的信号。 (J)单体直流正接)的水平显示为从控制= 3 N倍的变化(正。平均值±SEM显示的曲线图。统计分析使用单因素方差分析(C-F,J)或双尾配对 t 澳门新葡亰平台游戏app下载 克-i的); *, p<0.05; **, p<0.01; ***, p<0.001.

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接下来,我们测试的功能可以替代hCSPα无论内源性直流正接和恢复缺乏DCSP苍蝇过早杀伤力(z在smaier等的,1994)。适量苍蝇和由于进行性神经变性展览,麻痹和过早死亡缺少基因缺失小鼠(费尔南德斯 - 查孔等人的,2004; z在smaier等的,1994)。从纯合的转基因一个拷贝ELAV驱动标准hCSPα的泛神经元表达 直流正接 deletion mutants significantly restored adult lifespan from ~4–5 days to 15–20 days (LD50 p<0.001; 图1D)。相比之下,蝇直流正接2当前的表达只部分恢复成人寿命(图1D)。尽管救援是ESTA只是局部的,它证实hCSPα这是苍蝇的功能,这使得一 cln4果蝇 澳门新葡亰平台游戏app下载

值得注意的是,在神经元HCSP-L115的表达和-l116 直流正接 null background was able to partially rescue the lifespan deficit (p<0.001, LD50), although not nearly to the extent of WT hCSPα (图1D)。这表明ESTA cln4 hCSPα突变蛋白是至少部分功能。

cln4 突变导致形成耐SDS的低聚物和泛素化蛋白质在神经元hCSPα

在人类中, cln4 突变降低了脂化的单体hcspα的水平和驱动高分子量的形成,耐SDS-hCSPα蛋白寡聚体泛素化也就是说(贝尼特斯等人的,2015年; 油渣等的,2012; 亨德森等人去了。2016; 所述Nosková等人,2011)。这两种功能存在当存在时HCSP-L115突变体或-l116非神经元和神经元细胞培养物中表达随着L115哺乳动物表现出比L116效果更强(十去其ARDanuy等人,2017年; 油渣等的,2012; 亨德森等人去了。2016; 张和Ch和ra 2014)。

是否测试表达 cln4 hCSPα突变体 果蝇 神经元概括验尸人脑的病理特点,我们分析的性质 cln4 mutant hCSPα by immunoblotting, using protein extracts from larval VNCs. When expressed from a single transgene with an ELAV-Gal4 driver, lipidated monomeric prote在 levels of WT hCSPα were estimated to be 0.98 ± 0.23 times of endogenous dCSP levels (data not shown)。 In comparison, levels of lipidated monomeric hCSP-L115 and -L116 were significantly reduced to 13% 和 40% of WT hCSPα levels, respectively (p<0.003, 图2a中,d)。 Levels of lipidated hCSP-L115 monomers were significantly lower than hCSP-L116 (p<0.01, 澳门新葡亰平台游戏app下载 )。 非脂化单体的水平 hCSP-L115 和 -L116 were comparable to WT hCSPα levels (p>0.2; 图2a,和)。

cln4 在hCSPα耐SDS,高分子量低聚物的突变诱导形成 果蝇 neurons (p<0.002; 图2a,C)。与此相反,重量hCSPα低聚物可检测勉强(图2a,C)。 该 mutation L115 triggered oligomerization to a significantly larger degree than L116 (p<0.006; 图2c),这与HCSP-L115单体的较低水平(一致澳门新葡亰平台游戏app下载 )。在缓冲增加DTT的水平,以减少二硫键的小ADH对水平和HCSP-L115和-l116低聚物,其广泛应用于从〜250 kDa的变化,以超过500千道尔顿的尺寸没有影响(未示出)。

澳门新葡亰平台游戏app下载 cln4 低聚物泛素化hcspα突变,我们从免疫探测与抗体细胞裂解液和幼虫大脑蛋白印迹特异性检测k29-,K48-,和K63连接的单和多泛素化蛋白,但不是免费的泛素单体(hCSPα澳门新葡亰平台游戏app下载 )。免疫沉淀hcspαhCSPα单体和低聚物这两个抗体(图2b),但不内源性直流正接(未示出)。抗泛素化蛋白的抗体仅向L115强认可〜250 KD的蛋白质条带,并从沉淀L116突变体的大脑,其中在大小与高分子量hCSPα低聚物相关(图2b澳门新葡亰平台游戏app下载 cln4 hcspα突变体的单体,低聚物或单体hCSPα重量进行检测(图2b)。合在一起,这些数据提示的表达 cln4 在苍蝇大脑突变hCSPα再现关键的生化死后人的病理特点 cln4 脑(油渣等的,2012; 亨德森等人去了。2016; 所述Nosková等人,2011)。

齐聚 cln4 hCSPα突变体是剂量依赖性的

纯化齐聚 cln4 hCSPα突变蛋白是剂量依赖性的在体外(张和Ch和ra 2014)。测试是否是该体内的情况下另外,我们加倍WT的基因剂量和 cln4 mutant hCSPα 通过表达 two copies of the respective transgenes with a single ELAV-Gal4 driver. In comparison to the expression from one transgene, levels of lipidated and non-lipidated monomeric WT hCSPα 在creased ~2.4 fold 和 ~3.3 fold, respectively (p<0.01, 图2a中,D-E,H-1)。 Yet, WT hCSP oligomer levels 在creased only 1.5-fold (p<0.005; 图2G)并且保持低,使得所述低聚物/单体比例没有改变(P = 0.9; 图2c)。

In comparison to single copy gene expression, doubling gene dosage 在creased levels of lipidated hCSP-L115 monomers only modestly by 1.5-fold (p<0.04) while hCSP-L116 levels were not significantly affected (p=0.3; 图2h)。然而, levels of hCSP-L115 and -L116 oligomers 在creased 4.6- 和 3.6-fold, respectively (p<0.04; 图2G)。不成比例由于增加 cln4 突变体的低聚物,所述低聚物/ 0.9至2.8增加对HCSP-L115和0.4至1.8 HCSP-L116单体比率(图2c澳门新葡亰平台游戏app下载

Doubling expression disproportionally 在creased levels of non-lipidated hCSP-L115 and -L116 monomers 8.6- 和 4.6-fold, respectively (p<0.002, 图2I)。增加的非脂化不大可能由于速率限制机制中介棕榈酰化由于非脂化水平重量单体的效果远低于增加突变体的单体,即使脂质化重量整体水平是高得多的单体突变体的单体(图2e)。

Doubling gene dosage of hCSP-L115 and -L116 expression increased total overall prote在 levels 3.0 和 3.9-fold, respectively (p<0.002; 图1,图补充1D)。此外,它保存在重量和整体之间蛋白水平的相对差 cln4 突变体(图2F)。 以来 lipidated mutant monomer levels rema在ed unaltered (p>0.1; 澳门新葡亰平台游戏app下载 在整体蛋白质水平)增加 cln4 mutant hCSPα is essentially due to 在creased levels of oligomers 和 non-lipidated monomers (p<0.03; 图2c,电子)。

内源性DCSP单体的水平没有通过的低或高表达受影响 cln4 澳门新葡亰平台游戏app下载 澳门新葡亰平台游戏app下载 )。值得注意的是,内源性重量直流正接高分子量低聚物的表达后,未检测到 cln4 澳门新葡亰平台游戏app下载 图1位数补充1C澳门新葡亰平台游戏app下载 cln4 hCSPα突变体低聚物(油渣等的,2012)。

的neuronally表达齐聚 cln4 hCSPα突变杀伤力先于

重量的ELAV驱动的神经元表达或 cln4 从一个单一的突变体转基因的影响hCSPα的活力无ADH在开发过程中(图3a)和 adult lifespan (not shown)。然而, doubling gene expression levels severely reduced viability during development of hCSP-L115 和 -L116 animals 在 comparison to WT hCSPα expression (p<0.0001; 图3a)。 l115-成人逃生和L116突变体相比最初滞重量hCSPα改善,但〜10天内并表现出正常的寿命(未示出),这可能是由于在ELAV驱动的表达的降低。有一个在L115和L116活力突变体动物(p值= 0.91之间没有差异显著; 图3a)。在通过HCSP-L115和-l116两个拷贝表达诱导生存力的急剧下降表明神经毒性的紧密的阈值,这可能被链接到的多于3.6倍的增加 cln4 CSPα突变体低聚物和/或非脂化的单体的多于4.6倍的增加(图2g,我)。

cln4 突变导致剂量依赖性杀伤力和眼睛退化。

(A从一个或两个(2个)具有ELAV驱动器(N≥3中,n≥740)表达WT,L115,L116或突变hCSPα泛neuronally转基因动物)生活力。 (B的成年果蝇眼睛或hcspαhCSPα表达WT-L116 GMR-GAL4与在23℃和28℃的驱动程序)的图像。 (C)的半定量评估 cln4澳门新葡亰平台游戏app下载 A)和Kruskal-Wallis检验(C); *, p<0.05; **, p<0.01; ***, p<0.001.

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表达 cln4 澳门新葡亰平台游戏app下载 cln4 成人突变逃生是非常缓慢的,几乎不移动。他们还无法正确充气翅膀(图1-图1b的补充)与夭折在1-3天。

进一步研究在成人的潜在退化的影响,我们HCSP-L116独首页使用眼部专用GMR-GAL4驱动程序(表现在眼有等人的,1997)。 High-level expression of WT hCSPα from a line with multiple transgene insertions (see Materials 和 methods) had essentially no effect at 23°C or 28°C in comparison to non-express在g control (p>0.9; 图3B-C)。 In comparison, expression of hCSP-L116 at 23°C severely impaired the size, 在tegrity和 pigmentation of the eye (p<0.0001; 图3B-C)。 Raising flies at 28°C to 在crease Gal4 activity 和 thereby gene expression enhanced the severity of the degenerative phenotype of L116-mutant eyes (p<0.0001; 图3B-C)。相关因素随着HCSP-L116齐聚增强ESTA剂量依赖性增加(图2C中,克),但较高的温度也会增加错误折叠和/或突变体hCSPα的低聚。

cln4 hCSPα的突变影响突触本地化

此前,它已经表明, cln4 突变可能破坏CSPα的顺行贩卖由于形成低聚物或单体的受损要么棕榈酰化(贝尼特斯等人的,2011; 油渣等的,2012; 所述Nosková等人,2011)。然而,无论是 cln4 澳门新葡亰平台游戏app下载 RD instar larval NMJs with antibodies against hCSPα, endogenous dCSP marking SVs和 HRP mark在g the neuronal plasma membrane. In comparison to WT hCSPα, levels of mutant hCSP-L115 和 -L116 were significantly reduced at synaptic boutons (p<0.013; 图4a中,h)。表达 cln4 mutant or WT hCSPα had no effect on synaptic levels of endogenous WT dCSP at NMJs (p>0.6; 图4A中,我)。尽管减少突触水平,突变体hCSPα仍部分获救的寿命赤字 直流正接 缺失突变体,尽管未对重量几乎hCSPα的程度(图1D)。这表明ESTA cln4 hCSPα突变蛋白是至少部分功能。

cln4 hCSPα突变降低突触水平和原因异常积聚随着DCSP和泛素化蛋白质在轴突胞体和内源性。

澳门新葡亰平台游戏app下载 d-E,J -1-)或两个(A,H-i的澳门新葡亰平台游戏app下载 A)幼虫NMJs免疫染色hCSPα,内源性DCSP,和神经元膜标记HRP。白线表示在C所示的线扫描。 (B)幼虫VncS染色hCSPα。 (C从通过突触终扣单线扫描(白线在hCSPα和直流正接荧光的)图)。 (D染色hCSPα(红色)和)vnc的幼虫段赖氨酸连接的泛素 - 泛素化蛋白可视化(UBI-蛋白)。 (E澳门新葡亰平台游戏app下载 F)幼虫NMJ的突触布顿染色hCSPα和UBI-蛋白。 (G)近端幼虫节段性神经染色hCSPα。 (H-1)hCSPα的平均水平(H)和直流正接(I) at synaptic boutons of larval NMJs (N > 4)。 (J)累积异常积聚的区域中hCSPα幼虫大脑(N≥3)。 (K-L)平均累积的数目免疫阳性泛素两者hCSPα和(K),或者只为阳性泛素(L澳门新葡亰平台游戏app下载 A),20微米(澳门新葡亰平台游戏app下载 澳门新葡亰平台游戏app下载 D),10微米(E),5微米(F)。平均值±SEM显示的曲线图。统计分析使用单因素方差分析(H-L); *, p<0.05; **, p<0.01; ***, p<0.001.

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hCSPα而共定位的内源性DCSP随着均匀地在突触终扣的外周(图4a,C),HCSP-L115和-l116在明亮染色的簇中富集即从突触前膜更远(图4a,C)。相比于对照 cln4 也hCSPα突变体在节段性神经轴突(异常积累图4G)和 the larval bra在 (p<0.009; 图4b,J; 图4-图1A补充)。规模 cln4 在幼虫脑突变hcspα积累是异质的,范围从直径〜500nm至〜3微米。偶尔,突变体hCSPα的极端积聚在幼虫NMJs的突触终扣(观察澳门新葡亰平台游戏app下载 )。异常HCSP-L115和-l116积聚的发生是剂量依赖性的(未示出),这是最显着的在节段性神经轴突(图4G澳门新葡亰平台游戏app下载 cln4 澳门新葡亰平台游戏app下载

异常积聚 cln4 含有突变体hCSPαDCSP和泛素化蛋白重量

(未示出)HCSP-L115的异常积累和在轴突-l116的一小部分和胞体(图4E图4-图1A补充)含有显著DCSP金额内源性重量。因为重量DCSP未用的高分子量低聚物一起检测 cln4 Western印迹hCSPα突变体(图1位数补充1C),这表明 cln4 对细胞内的膜突变体和重量hCSPαDCSP五月共累加。

澳门新葡亰平台游戏app下载 cln4 可以在hcspα突变ER,高尔基体膜或异常SVP积累在分泌贩卖。另外,突变hcspα积聚在体膜莫非是靶向降解。无论是测试突变hCSPα泛素化蛋白含有积累指示prelysosomal膜的,我们使用的抗体检测泛素化蛋白这独首页而非单体泛素(澳门新葡亰平台游戏app下载 )。事实上,所有的本质 cln4 hCSPα突变积累免疫阳性泛素化蛋白在NMJs的胞体和突触终扣分别为(图4D,F图4-图1b中的补充)。相比于幼虫表达WThcspα,泛素化蛋白hCSPα积累含量在显着增加 cln4 突变体(p<0.001; 图4K)。因此,异常积聚 cln4 突变体hcspα富集泛素化hCSPα要么低聚物和/或包含潜在去往蛋白降解其他泛素化蛋白。

针对hCSPα和泛素化蛋白共免疫染色揭示了泛素化蛋白水平大幅增加目前并没有随着那积累相关 cln4 澳门新葡亰平台游戏app下载 图4D图4-图1b中的补充)。控制大脑(w1118)和幼虫表达WThcspα含有像泛素化蛋白质的量灶是阴性的对hCSPα(图4L), indicating that expression of WT hCSPα exerts little to no effect on protein ubiquitination. In comparison, the amount of ubiquitinated protein foci that were not associated with mutant hCSPα was significantly increased in brains express在g hCSPα-L115 or -L116 (p<0.03; 图4L澳门新葡亰平台游戏app下载 cln4 突变hCSPα可能影响直接间接或蛋白动态平衡的一步,导致不相关的蛋白质的过多的蛋白质泛素化。

cln4 在苍蝇和人类QS突变有类似的效果

来验证所观察到的表型 cln4 这种突变hCSPα并排除他们不是在表达神经元飞突变的人类蛋白质的神器,我们我们表达 cln4 含有突变dcsp2突变体(直流正接2)容器v117r和i118δ到突变l115r和hCSPαl116δ(这类似于图1a)。 All fly transgenes were inserted at the same transgenic insertion site as the human transgenes. Elav-driven neuronal expression of dCSP2, dCSP-V117, or -I118Δ from a single transgene had no effect on viability dur在g development at 23°C (not shown)和 27°C (p>0.4; 图4位数补充第二)。在27℃成人寿命C为当前标准(澳门新葡亰平台游戏app下载 )。然而,倍增的基因表达水平严重降低表达WT直流正接,直流正接-v117或-i118δ(动物的生存力图4-图2b补充)。值得注意的是,一些成人重量DCSP和直流正接-v117动物表现粗糙的眼睛,异常膨胀的翅膀,受损的运动和死在一天之内(未显示)。表达DCSP-I118成人苍蝇从未观察到。

cln4 突变体hCSPα,单体的水平脂化直流正接-v117和-i118相比与wt DCSP(分别降低图4-图2c补充)。类似CON SUS L115人类模拟(图2a),V117更严重降低单体DCSP的水平(图4-图2c补充)。此外,这两种v117和I118触发耐SDS,高分子量低聚物的形成(图4-图2c补充),测定其重量dCSP2缺席表达。表达直流正接2-v117和-i118 直流正接 有一个像效应缺失突变体(图4-图2c补充)。因此,病理主导的特征 cln4 突变降低脂化QS单体和寡聚化水平是保守的蛋白苍蝇和人类之间的QS触发。

确定的亚细胞定位 cln4 突变DCSP在苍蝇的神经元,我们表达规律和 cln4 从单一转基因的突变体蛋白在神经元的纯合子 直流正接 澳门新葡亰平台游戏app下载 图4-图2E-F补充)。在幼虫大脑的神经元轴突胞体和(也直流正接s突变积累异常图4-图2e中的补充)。

cln4 hCSPα上prelysosomal内涵体突变积聚

进一步定义的共聚集的性质 cln4 随着hcspα泛素化突变蛋白,我们测试了一些细胞器标记为潜在的共定位。突变体不共定位hCSPα积累与内质网(ER),顺式,或反式 - 高尔基复合体(图5a),其中排除在ER或高尔基贩卖重大缺陷。

cln4 hCSPα上lamp1-和小时阳性内涵体突变的积聚。

HCSP-L116是在幼虫的神经元ELAV-GAL4与司机从一个转基因表达。所指示的,表达相应的共报道了转基因。 (A幼虫的)神经元共免疫染色VncShCSPαGFP标记和ER-KDEL,顺式高尔基体标记物GMAP,或反式高尔基体标记物245 golg在(B)神经元共免疫染色hCSPα(网络)和共表达hlamp1-GFP,未婚-GFP或的pI3澳门新葡亰平台游戏app下载 C细胞器标记物colocaliz在g随着hCSPα积累(平均值±SEM,N≥65)分数,N≥4)。 (澳门新葡亰平台游戏app下载 )共染色为hCSPα和的Atg8 / LC3-GFP幼虫大脑的段(D)或小时(E)。 (F)在幼虫NMJs突触终扣共同染色hCSPα和小时。 (G)联合免疫染色hCSPα和共同表达GFP-nsyb神经元。比例尺:10微米(澳门新葡亰平台游戏app下载 ),5微米(A-B,F-G)。

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突变体hCSPα的很大一部分共同积累随着hlamp1-GFP(图5B-C),哪些标签到细胞器从预降解核内体降解物种到溶酶体的异质群体(Cheng等的,2018; saftig和klumperman,2009年; 邑等的。,2018)。的突变体hCSPα共肝细胞生长因子类似大部分积累随着调节酪氨酸激酶底物(小时, 图5c和),这是“的运输需要内体排序络合物”(ESCRT从早期到晚期内体介导的过渡的关键组成部分)(raiborg和Stenmark,2009年)。只有一小部分共定位随着共表达Rab5的-GFP(未示出)或标记自噬体的Atg8 / LC3-GFP(澳门新葡亰平台游戏app下载 )。没有共定位观察到溶酶体老处女-GFP(图5b; 荣等人到,2011; 斯威尼和戴维斯,2002年)或晚期内涵体蛋白质RAB7(未示出; 战争与布奇年,2016年)。

值得注意的是,内涵体hCSPα累积突变体不共定位随着共表达磷脂酰肌醇-3-磷酸(PI3p)的FYVE-GFP传感器(图5b),尽管小时PI要求3p表示膜协会(迈耶斯等人的,2013; raiborg等的。,2001年)。因此,这表明,所有的PI3p结合位点可对异常核内体积累突变hCSPα占用。可替代地,PI3p可为这些内涵体,这将意味着小时的异常保留缺席。加在一起,表明这些数据 cln4 hCSPα突变体累积在prelysosomal即内涵体被无效率地对溶酶体融合处理。

具有一致的突变体hCSPα的共定位在与轴突终末泛素化蛋白(图4F)在共定位随着突触终扣hCSPα突变体NMJs的另外小时(图5F澳门新葡亰平台游戏app下载 图5C中,克)虽然一小部分共定位随着突触质膜蛋白突触1A(未示出)。 CSPα伴侣客户的发动和SNAP-25(Sharma等的,2011; Zhang等人,2012)不共定位随着hCSPα阳性内体(未示出)。

cln4 突变引起的内切膜神经元胞体和轴突各种超微结构异常

以来 cln4 突变体hcspα异常积聚在prelysosomal内涵体,我们使用电子显微镜来检测膜电位贩卖超微结构缺陷。诱导hCSPα-L115高度异常和-l116的表达神经元膜结构在胞体,幼虫VNC的神经纤维,和节段神经轴突(图6澳门新葡亰平台游戏app下载 澳门新葡亰平台游戏app下载 )。像hCSPα阳性内体通过共焦显微镜检测积累,膜回旋最经常在VNC和节段性神经轴突的神经毡观察(图6C-d)。在较小的程度,它们存在于神经元胞体的细胞质中(图6A-B,F-G)而且偶尔核质(未示出)。偶尔,回旋被相邻小区的质膜的相对侧(箭头发现 图6B)。

cln4 内膜突变引起异常结构和EM-密集堆积。

超薄的TEM显微照片(70纳米)从幼虫VncS部分HCSP表达L115或-l116随着从两个转基因拷贝的ELAV驱动程序。基因型表示。 (澳门新葡亰平台游戏app下载 澳门新葡亰平台游戏app下载 B),偶尔“残余溶酶体”(白色箭头,(A),浮肿的高尔基apparati(B澳门新葡亰平台游戏app下载 B)。 (C在含有神经元膜procesos(黑色箭头)回旋幼虫VNC容器的)神经纤维。 (D含有幼虫节段性神经膜容器回旋和异常的)矢状切面自噬体一样在感觉神经元和发动机的轴突结构。 (E-H)高放大倍数图像示出与品种多样的管腔内囊泡的残余溶酶体(E),各种形式的EM-致密膜回旋(F-G)和自噬体状结构(白色箭头,(克-i的),可能与互动EM-密集结构(白色箭头,(G),以及电子致密细胞外沉积物(H)。比例尺:1微米(澳门新葡亰平台游戏app下载 ),200纳米(澳门新葡亰平台游戏app下载 )。

//doi.org/10.7554/elife.46607.011

除了在对电子致密膜回旋,多个次级(剩余)溶酶体(图6a中,并)和异常autophagosome- /或amphisome状和结构存在(白箭头, 图6F-I)。有趣的是,EM-致密膜形成回旋会发生相互作用,与自噬体(箭头, 图6G)。值得注意的是,有些像“膜抡”和自噬体状结构是在功能的突变体,包括TSG101 snf7 / chmp4b,Vps4和CHMP2B的各种ESCRT损失测定值(doyotte等人的,2005; Lee等的,2007; 拉齐和futter,2006年)。

旁边膜异常的结构,在细胞被频繁的区域未知性质本的电子致密均匀的积累 cln4 幼虫突变体的大脑(箭头, 图6b中,h)。到限制膜则没有检测到对于的死后人组织中观察到这些EM-致密积累,这是相同的,但不是让人想起嗜高渗粒状沉积物(grods) cln4 患者(Anderson等的。,2013; 地榆等人的,2003; 所述Nosková等人,2011; 维尔马尼等人的,2005)。由于VNC从神经纤维和神经节段没有这些结构,不可能在轴突突变hCSPα的异常核内体积累相关他们。

最后,还含有异常的膜结构的一些神经元表现出的核包络的严重碎裂和高尔基池臃肿(图6B),其中一起可能指示神经元功能障碍和神经退行性疾病的后期阶段(尼克松,2006年)。

ESCRT导致的内源性直流正接,但没有齐聚的功能内涵体积累的损失

要验证重量适量通常是通过内切溶酶体途径贩卖,我们通过肿瘤抑制基因101(TSG101)的RNAi介导的击倒(KD)是哪个的一部分ESCRT-I复合物作用的下游受损ESCRT功能小时,并且在需要晚期内体的形成(doyotte等人的,2005; 拉齐和futter,2006年)。 TSG101的神经元的kd引起内源性直流正接,上小时阳性内涵体在幼虫VNC的神经纤维和神经元胞体(其中积累的错位图5位数的补充1A)。在幼虫NMJs突触终扣的中心区域是DCSP异常积聚还存在(图5,图1b的补充)。因此,重量QS是容易被降解,虽然内切溶酶体途径。结论是ESTA在人成纤维细胞,N2a细胞,小鼠的神经元,和溶酶体富集馏分溶酶体相关CSPα的低量(一致贝尼特斯和金沙,2017年; 教堂等人,2013; 施罗德等人的,2007; tharkeshwar等的,2017年)。

值得注意的是,TSG101的KD本质上模仿异常核内体积累 cln4 突变hcspα-L115和-l116一个重要的例外。在对比hCSPα-L115和-l116表达,TSG101的KD不引起高分子量低聚物DCSP的形成(图5,图1C补充),表明适量的低聚物的形成是独立ESCRT功能受损的。对比显示溶酶体活性受损最近的一份报告,在小鼠的神经元减少CSPα的棕榈(Sambri等人的,2017年),功能受损prelysosomal ESCRT对直流正接的棕榈酰化状态没有影响。

cln4 HCSP-L115等位基因和-l116是功能突变的hypermorphic增益

几种假说关于显性的遗传性质 cln4 建议已突变。 hcspα突变体的单体和/或低聚物作为显性莫非否定即重量hcspα和封存逐渐耗尽池功能hCSPα,这反过来触发莫非神经变性(油渣等的,2012; 所述Nosková等人,2011; 张和Ch和ra 2014)。或者, cln4 经由不同的增益的函数(GOF)机制突变等位基因五月诱导毒性(油渣等的,2012; 亨德森等人去了。2016; Zhang等人,2012)。这样的突变可以增加蛋白(hypermorphic突变)的GOF正常活性或引入新的活性(新变体突变)。从理论上讲,无论哪种类型的突变可以引发神经毒性。

解决的基因遗传性质 cln4 突变,到什么程度,我们审查DCSP的改变重量hCSPα水平或L115 L116和可能影响的表型。理这些遗传实验背后简单地是:应增强降低水平重量显性阴性表型,由于减少的表型hypermorphic平均增加的活性,或对新变体的表型没有影响,由于一个新的蛋白质活性(穆勒,1932年; 澳门新葡亰平台游戏app下载 )。

DCSP WT通过表达转基因的两个拷贝减少内源性水平 cln4 HCSP在杂合突变 直流正接 缺失突变体抑制由显着诱导的致死率 cln4 mutations such that significantly more animals reached adulthood (p<0.02, 图7A)。 Conversely, increasing levels of WT hCSPα by co-express在g WT hCSPα with either one copy of hCSP-L115 or -L116 significantly reduced viability to ~54% 和 48%, respectively (p<0.001, 澳门新葡亰平台游戏app下载 )。由WT的共表达和诱导的致死率 cln4 mutant hCSPα was significantly higher than the lethality 在duced by two copy expression of WT hCSPα (p<0.03, 澳门新葡亰平台游戏app下载 )。因此,改变的直流正接重量或hCSPα水平上l115-和L116诱导的致死性的调节作用本质上排除,要么作为一个显性突变作用阴性的可能性。相反,这些作用与基因突变hypermorphic GOF的特性(一致穆勒,1932年; 澳门新葡亰平台游戏app下载 )。

改变野生型水平QS MODIFIES cln4 表型。

重量hCSPα,HCSP-L115或-l116在神经元中表达来自一个或两个的转基因(2×)随着驱动器控制的ELAV(w1118),杂合子 CSPX1 / +和纯合子 CSPX1 / R1 缺失突变体,或共表达了hCSPα或直流正接重量。基因型表示。 (澳门新葡亰平台游戏app下载 减少内源性直流正接的)效果(A)或共表达重量hCSPα(公元前) on the viability of hCSP-L115 和 -L116 mutant flies (N > 3; n > 144)。 (澳门新葡亰平台游戏app下载 )从探查β微管蛋白和hcspα(负载对照)表明基因型的幼虫VNC蛋白提取物的免疫印迹。 hcspα低聚物(OM),脂化(LM),非脂化的hCSPα单体(NLM),和非特异性信号(*)表示。 (F-ñ澳门新葡亰平台游戏app下载 F-^ h)增加DCSP(我知道),以及重量增加hCSPα(澳门新葡亰平台游戏app下载 上hCSPα低聚物)的水平(F,I,L),脂化的单体(G,J,米),和非脂化的单体(H,K,N)。归一化至负载控制和绘制为L116 L115的正倍数变化或信号当水平背景重量(N = 5)表示。平均值±SEM显示的曲线图。统计分析使用非配对 t 澳门新葡亰平台游戏app下载 A,I-1)或单因素方差分析(B-C,F-H,M-N); *, p<0.05; **, p<0.01; ***, p<0.001.

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接下来,我们判断是否改变水平重量Q可以调节的倾向 cln4 突变体hCSPα以形成高分子量的异常的低聚物。通过表达重量DCSP降低水平 cln4 在杂合或纯合突变体hCSPα 直流正接 deletion mutants significantly attenuated the levels of SDS-resistant hCSP-L116 和 -L115 oligomers (p<0.05; 图7D,F)。 Levels of hCSP-L116 和 -L115 oligomers were attenuated to a similar degree (p>0.5; 图7F)。相反,通过增加与单个水平升高重量DCSP共表达的转基因一起重量 cln4 mutant transgene 在creased the amount of hCSP-L115 和 L116 oligomers (p<0.007, 澳门新葡亰平台游戏app下载 )。 Coexpression of WT hCSPα also significantly 在creased oligomerization of both hCSP-L116 和 -L115 (p<0.008; 图7E,L)。相比较而言,从两种转基因重量hCSPα高水平过量表达不诱导显著低聚(澳门新葡亰平台游戏app下载 图2a,C)。

In contrast to the modulatory effects of WT CSP on mutant hCSPα oligomer levels, reducing or even abolish在g WT dCSP levels had no effect on the levels of lipidated monomeric hCSP-L115 和 -L116 (p>0.4; 图7G)。共表达重量直流正接2或hCSPα随着 cln4 hCSPα突变体creased lipidated mutant hCSPα monomers (p<0.05; 图7J,米)。值得注意的是,重量hcspα的共表达脂化提高不HCSP-L115和-l116单体类似于在水平是那些两个拷贝重量hCSPα表达式(图7米)。这表明ESTAhCSPα五月重量稳定 cln4 hCSPα突变体单体。

非脂化单体的水平 cln4 mutant hCSP were unaffected by reduc在g the gene dosage of endogenous WT dCSP2 (p>0.3; 澳门新葡亰平台游戏app下载 澳门新葡亰平台游戏app下载 cln4 hCSPα突变体creased levels of non-lipidated mutant hCSPα monomers (p<0.05; 图7K,N)。 At least the increase induced by WT hCSPα was non-additive since it was significantly larger than the increase induced by doubl在g WT hCSPα expression (p<0.013; 图7N澳门新葡亰平台游戏app下载 cln4 对于棕榈突变hCSPα,或者宣传depalmitoylation。

最后,我们测试了内源性无论改变的水平直流正接也影响其他表型 cln4 fly 模型。 Indeed, reducing dCSP levels by one gene copy significantly suppressed the endosomal accumulation of both hCSP-L115 和 -L116 在 larval VNCs (p<0.05; 图8A-B)。减少 dCSP gene dosage also decreased the amount of accumulating ubiquitinated proteins 在 the larval VNC (p<0.04; 图8C)。然而, reduced dCSP levels significantly enhanced the already reduced synaptic prote在 levels of hCSP-L115 和 -L116 at larval NMJs (p<0.03; 图8d)。对于后者效果的根本原因尚不清楚。

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上水平降低的直流正接影响 cln4 澳门新葡亰平台游戏app下载

重量hCSPα,HCSP-L115或-l116表达在神经元随着驱动器控制的ELAV(w1118),杂合子 CSPX1 / +,或纯合子 CSPX1 / R1 缺失突变体。 (A)幼虫VNC染色hCSPα和直流正接。基因型表示。比例尺,20微米。 (B-d的降低)效果 直流正接 上HCSP-L115的幼虫VNC的积累和-l116基因剂量(B,N≥3),在幼虫VncS泛素化的蛋白水平(C,N≥4),和HCSP-L115的突触水平,并在-l116幼虫NMJs (d,N≥4)。被归一化的信号和标绘为n重到ELAV-L115的变化水平和重量背景对照-l116表达。平均值±SEM显示的曲线图。用来配对的统计分析(D)和不成 t 澳门新葡亰平台游戏app下载 公元前); *, p<0.05; **, p<0.01; ***, p<0.001.

//doi.org/10.7554/elife.46607.013

一起,改变的调节作用WT上存活力l115-和L116诱导的表型飞和人类适量水平,hcspα低聚突变体,在核内体的积累和泛素化蛋白表明HCSP-L115和-l116等位基因的功能hypermorphic增益突变增加的内在活性。结论ESTA是用最近的研究中示出同样在小鼠成纤维细胞表型HCSP WT-l115rcspα的基因剂量影响相符CSPα缺陷型(贝尼特斯和金沙,2017年)。此外,这些发现揭开的缩小存活率之间的相关性 cln4 突变果蝇,低聚突变hCSPα度和降解的低聚物的失败。

CSPα的伴侣伙伴抑制了部分损失hsc70-4 cln4诱导的表型

hypermorphic的性质 cln4 的可能性,突变凸起中的至少一些通过增加分子伴侣适量的随着HSC70中导致异常共伴侣活性,这通常SV外切和确保通过陪伴可能SNARE蛋白和dynam在上高效的内吞作用(诱发的表型的Ch和ra等的,2005; 聂等人的,1999; Sharma等的,2012; Sharma等的,2011; Zhang等人,2012)。可能性地址ESTA,我们测试了圈套无论改变的蛋白质或HSC70可修改通过的表达引起的眼表型水平GMR驱动 cln4 澳门新葡亰平台游戏app下载 图9A)。

减少HSC4衰减的基因剂量 cln4 表型。

(A)表达hCSPα重量(对照)或HCSP-L116 GMR-GAL4与在不存在或一个杂合+/- HSC4的存在驾驶员苍蝇成人眼(HSC4Δ356)删除,以HSC4 KD(34836),OE syx1a或SYB的。 (B-d从指示基因型的幼虫VncS提取物)免疫印迹探查hcspα。脂化的单体HCSP(LM),非脂化的HCSP(NLM)和低聚物hCSPα(OM)表示。表达随着ELAV驱动器各自的转基因;对照 w1118。 β微管蛋白用作上样对照。( E)对改性剂的遗传效应半定量评估 L116诱导的眼表型(N≥12)。( F澳门新葡亰平台游戏app下载 w1118)或杂合 HSC4Δ356 deletion background (N ≥ 3; n > 74)。 (克-K的降低)效果 HSC4 基因剂量对hCSPα低聚物水平(G),脂化的单体(H),非脂化的单体(I)和总蛋白水平(J)。 Signals were normalized to loading control 和 plotted as n-fold change to levels induced by ELAV-driven expression of hCSP-L115 or -L116 在 a WT control background (N > 6)。 (K减少)的影响 HSC4 上基因剂量脂化的重量hCSPα单体水平(N = 4)。 (L的降低)效果 HSC4 在幼虫VNC(N≥4)HCSP-L115 / L116的内体积累基因剂量。 (M-N的降低)效果 HSC4 在幼虫VncS泛素化的蛋白水平的基因剂量(M,N = 5)和突触HCSP-L115 / L116表达水平在NMJs幼虫(N,N = 6)。被归一化的信号和标绘为从以wt背景对照ELAV-L115 / L116表达水平正倍数变化。 (O幼虫共表达HA标记的VncS HSC4的)运动神经元胞体随着hcspα-L115突变体或染色-l116具有和hCSPα。比例尺:20微米(K澳门新葡亰平台游戏app下载 M)。平均值±SEM显示的曲线图。统计分析使用未配对 t 澳门新葡亰平台游戏app下载 F,M),配对 t 澳门新葡亰平台游戏app下载 L,N),或单向方差分析(E,G-J); *, p<0.05; **, p<0.01; ***, p<0.001.

//doi.org/10.7554/elife.46607.014

通过在杂表达HCSP-L116减少内源性hsc70-4(HSC4)水平 HSC4Δ356 缺失突变体(布朗克等人的,2001澳门新葡亰平台游戏app下载 图9a,和)。转基因的敲低UAS发夹HSC4当前L116抑制眼睛表型(P = 0.007共表达; 图9a,和)。然而, reducing the gene dosage of Hsc70-3 or Hsc70-5 had no effect (not shown), indicating that the suppression of L116-mutant eye phenotypes by reduced levels of Hsc4 is not a general effect of Hsc70 proteins. Co-expression of either Syntaxin 1A (Syx1A) or neuronal Synaptobrev在 (nSyb) with hCSP-L116 enhanced the L116 eye phenotype (p<0.01; 图9a,d)。过表达或RNAi介导的敲低SNAP25 ADH没有影响(未示出)的,即使SNAP25的杂合缺失增强退行性hCSPα敲除小鼠的表型的(Sharma等的,2012)。突触1A(syx1a),神经元突触(nsyb)的个体过表达,SNAP25或对ADH眼睛没有影响(未示出)。

是否进一步测试HSC4至少部分五月贡献 cln4 表型,我们研究由泛神经元表达引起的致死率水平改变的影响HSC4 cln4 hCSPα突变。减少的基因剂量 HSC4 通过表达突变型L115 L116或HCSP-在杂 HSC4Δ356 deletion mutants significantly suppressed their lethality (p<0.0001; 图9F)。因此,HSC4有助于毒性 cln4 突变。

接下来,到什么程度我们研究水平改变HSC4有助于缓解齐聚 cln4 澳门新葡亰平台游戏app下载 Hsc4 OE had no significant effects on the amount of hCSP-L115 and -L116 oligomers, monomers 和 overall prote在 levels (p>0.05; 图9-图1a-d补充)。然而,降低的水平HSC4通过表达突变型L115 L116或HCSP-在杂 HSC4Δ356 deletion mutants significantly reduced the amount of hCSP-L115 和 -L116 oligomers (p<0.02; 澳门新葡亰平台游戏app下载 ) but had no differential effects (p>0.8)。 It also reduced the levels of lipidated and non-lipidated hCSP-L115 和 -L116 monomers, as well as overall prote在 levels (p<0.05; 图9H-J)。整体降低 cln4 hcspα突变体可能是由于对正则HSC4表达水平hcspα的一般依赖。然而,这是不可能的,因为HSC4还原性对的单体重量的hCSPα水平无影响的水平的情况下(图9K),这与观察到的通常DCSP水平相一致 HSC4 缺失突变体(布朗克等人的,2001)。

Reducing Hsc4 levels also suppressed the amount of hCSP-L115 和 -L116 protein accumulations on endosomes 在 the larval VNC (p<0.05; 图9l图9,图1E补充)。 It also suppressed the amount of ubiquitinated protein accumulations induced by hCSP-L116 (p<0.05) but had no effect on L115-在duced levels (p=0.8; 澳门新葡亰平台游戏app下载 )。减少 HSC4 在NMJs(P = 0.7不HCSP-L116幼虫的突触水平ADH基因剂量效应; 图9N)。然而, it further lowered the synaptic levels of hCSP-L115 (p<0.01; 图9N)。对于不同的影响,这些根本的原因还不清楚。

总之,的抑制效果降低 HSC4 在低聚和的异常积累基因剂量 cln4 在核内体突变hCSPα建议HSC4大大有助于此病理。 HA-标记的自共定位HSC4随着HCSP-L115和-l116的异常积聚(图9日)可能会干扰它随着prelysosomal贩卖和突变hcspα的随后的降解。一致地,HSC4较低水平降低的突变体蛋白质的总体水平,但不重量hCSPα(澳门新葡亰平台游戏app下载 )。

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为了更好地了解底层机制病理 cln4澳门新葡亰平台游戏app下载 果蝇 无论是通过表达模型 cln4 hcspα在神经元中突变体或直流正接。病理死后人的突变体要么hCSPα或镜像DCSP关键的神经元表达功能 cln4 大脑,降低棕榈酰化包括水平hcspα单体和低聚物的过量形成。随着泛一致这一概念有可能齐聚的结果,检测hCSPα只有泛素化突变体的低聚物,但没有泛素化的单体。一般突变L115 L116具有较强的影响比,已经在死后的大脑和哺乳动物细胞培养也观察到(十去其ARDanuy等人,2017年; 油渣等的,2012; 亨德森等人去了。2016; 张和Ch和ra 2014澳门新葡亰平台游戏app下载 cln4 hCSPα在苍蝇的神经元突变或DCSP提供有效 cln4 疾病模型。

在表型的剂量依赖性 果蝇cln4 模型

评估的剂量依赖性 cln4 在飞行模式的表型,我们控制的转基因表达的基因剂量 cln4 通过neuronally表达突变无论单或双突变体的转基因以两种内源性基因拷贝DCSP重量存在hCSPα。

单拷贝的表达 cln4 hcspα突变并没有引起检测或变性的杀伤力,即使泛素化hcspαprelysosomal低聚物和hCSPα的异常堆积的显著水平存在。然而,加倍基因剂量减少的生存力 cln4 由于神经退行性疾病的变异果蝇,这可能是所指示的fragmentated核信封和“臃肿”幼虫的神经元的高尔基池(图6B)。在生存力的下降显著指示的神经毒性的尖锐的阈值,这是相关的随着hCSPα低聚物和prelysosomal积聚的水平的增加。与神经元发生故障一致的,成人的自发活动逃生显示减少。

澳门新葡亰平台游戏app下载 cln4 hCSPα突变。在这些病理特点的积累 cln4 随着飞行模型假定同意迟发性神经退行性疾病,通常表现在蛋白质动态平衡经过长期的渐进积累的蛋白聚集体和缺陷是由在蛋白的动态平衡,衰败中年龄依赖性的能力(满足的整体概念Labbadia和森本,2015年)。

cln4 hCSPα的突变影响突触本地化

这推测先前的研究 cln4 突变可能会破坏hCSPαSV贩运和/或定位(贝尼特斯等人的,2011; 油渣等的,2012; 所述Nosková等人,2011),主要存在于,因为它们棕榈酰化适量适量的域。该 cln4 飞ESTA预测模型确认在两个方面:第一, cln4 澳门新葡亰平台游戏app下载 cln4 DCSP ADH突变苍蝇般不计的可能性,这些缺陷是表达飞神经元人类蛋白质的后果影响。

原则上,有两种可能性如何 cln4 澳门新葡亰平台游戏app下载 cln4 主要五月突变损害CS域,这是需要ER和高尔基退出的棕榈酰化,并用的SVP和/或SVS(稳定协会油渣和张伯伦,2006年; 澳门新葡亰平台游戏app下载 ; 大山等人的,2007; 斯托尔斯和Isacoff,2007年)。然而,这是不太可能的情况下可能性,因为hCSPα突变体是不是在飞神经元的内质网或高尔基体检测。此外,水平的非脂化 cln4 为突变体hcspα类似与wthCSPα当从一种转基因拷贝表达。 2) cln4 主要齐聚五月通过夸大的CS域二聚化的特性引起的突变(徐等人,2010)这样的自缔合,导致主要是高分子量的错误折叠的低聚物。值得注意的是,齐聚 cln4 澳门新葡亰平台游戏app下载 十去其ARDanuy等人,2017年),这与想法一致 cln4 pr在cipalmente突变诱导齐聚。

在飞神经元,与离开高尔基要么的SVP在其关联之后显然触发突变hCSPα的低聚,或在轴突终末到达和相关联SVS以后。 SVP到的内涵体SVS电荷或过渡还不是很清楚,但在原则上可以的SVP保险丝SVS,突触质膜,和核内体(里佐利2014)。与此相反,SVS是通过内吞作用要么超快,或新鲜内吞单SVS的熔丝(能力随着核内体连接到内体hoopmann等人的,2010; Soykan等人的,2017年; 渡边和boucrot,2017年; Watanabe等的。,2013a; Watanabe等的。,2013b)。 hcspα突变体低聚物是重新路由从潜在两者的SVP和SVS由于一些突变体hCSPα共定位与轴突终末SVS。然而,重路由泛素化的低聚物可能减少突触水平的主要因素 cln4 澳门新葡亰平台游戏app下载

泛素化 cln4 低聚物hCSPα突变,表明它们可能错误折叠,从而为泛素化和降解像其他错误折叠的蛋白质目标(Wang等人,2017年)。一致,仅泛素化的突变体,但在神经元蝇中没有检测到泛素化hCSPα低聚物的单体。因为重量DCSP(图5图1的补充)和hCSPα被溶酶体降解大多(贝尼特斯和金沙,2017年; 教堂等人,2013; Sambri等人的,2017年; 施罗德等人的,2007; tharkeshwar等的,2017年),人们期望泛素化突变hcspα齐聚物分拣到通道内溶酶体如果他们保持关联有隔膜。 ESTA看来是因为大多数异常累积的情形下在飞代表神经元核内体prelysosomal,这是由泛素化蛋白的共定位和prelysosomal标记LAMP1-GFP和小时定义突变hcspα。最后,通过减少DCSPhcspα或HSC4突变表型的抑制突变体揭示的hCSPα低聚之间有很强的链路水平,ITS prelysosomal重路由到膜上,并且其诱导的致死性(图78)。因此,建议这些数据 cln4 五月突变pr在cipalmente诱导膜相关hCSPα,这将导致泛素化和重新路由到溶酶体途径齐聚。

cln4 澳门新葡亰平台游戏app下载

prelysosomal轴突含有核内体有可能突变体hCSPα逆行贩卖容器溶酶体降解溶酶体自处理容器含有组织蛋白酶B / d不存在从本质上讲远端轴突(Cai等的,2010; Cheng等的,2018; GOW里斯HANKAR等人的,2015年)。既轴突贩卖和内涵体prelysosomal含潜在突变hcspα的成熟受损。轴突贩卖的物理缺陷是由大尺寸的hCSPα积聚物和由大和异常EM-致密膜结构中的轴突的频繁发生指示的 cln4 突变体,其有潜力“堵塞”轴突。

在突变体hCSPα阳性核内体prelysosomal的成熟中降低的效率是由它们的异常大的尺寸,并通过他们未能共同标签与PI指示的3p FYVE-GFP记者脂质。后者可能是由于两个选择:第一,hCSPα阳性内涵体可能有定期PI3P水平但大部分是由PI结合3对 - 结合蛋白。至少在某种程度上,这可能是协助开展了小时(raiborg等的。,2001年),有力地共同标签与hCSPα积累。可替代地,PI3澳门新葡亰平台游戏app下载

因为只有少数突变hcspα共定位,积累早期核内标记随着Rab5的,但没有积累本质上共定位与已故内涵体或溶酶体标记RAB7和老处女,有可能突变hCSPα可能损害从早期到晚期内的过渡。

澳门新葡亰平台游戏app下载 cln4 突变轴突和胞体IMPAIR步骤膜运输。因为ESCRT功能的破坏(后观察到类似的超微结构缺陷doyotte等人的,2005; Lee等的,2007),所述的异常内体膜 cln4 推荐在突变体prelysosomal运输缺陷。这是通过突变体hCSPα对prelysosomal膜包括的Atg8 / LC3-GFP阳性的自噬体的累积进一步支持。可替换地,至少一些的异常膜结构的 cln4 突变体可能是缺陷错误折叠胞质非常规的蛋白质的分泌的结果,这是由易化蛋白QS至少在非神经元细胞(Xu等的。,2018)。

cln4 也飞模型提供了一般的蛋白泛素化缺陷的证据。两者的 cln4 突变引起的神经元轴突和胞体泛素化蛋白积聚了未关联随着积累的增加 cln4 hCSPα突变。具有改变蛋白质一致的动态平衡,蛋白质和脂质组显著变化中发现的 cln4 突变体死后脑(亨德森等人去了。2016)。即使 cln4 突变CSPα的激发HSC70的ATP酶活性的能力在体外逐步恶化(张和Ch和ra 2014),蝇模型的过度泛素化的表型是不太可能由于减少适量/ HSC70伴侣功能,因为直流正接与wt减少泛素化水平抑制的影响。因此,过度的泛素化可以通过贩卖prelysosomal引起的缺陷的次级结果 cln4 突变。

cln4 等位基因遗传相似功能的突变hypermorphic增益

此前,它已经建议逐步齐聚 cln4 突变体hcspα可能通过螯合引起显性负性效果和wtCSPα消耗(油渣等的,2012; 亨德森等人去了。2016; 所述Nosková等人,2011; 张和Ch和ra 2014)。然而, cln4 hcspα突变体对的内源性重量DCSP的在飞模型突触和整体水平没有影响。另外,减少或甚至废重量DCSP形成减少的突变体hCSPα低聚物。这两种效果都与L115 L116和突变显性负效应不一致。此外,其他表型的遗传分析发现,没有证据支持的显性负效应 cln4 飞行模式。相反,ESTA的分析表明,大部分观测到的表型是由于获得对功能的影响。

消除或减少电平重量DCSP低聚和内体抑制的累积 cln4 hcspα突变体,所述升高的蛋白质泛素化和过早杀伤力。增加重量DCSPhCSPα或低聚水平和增强的杀伤力 cln4 突变。合在一起,这些结果表明,各个表型功能突变hypermorphic的增益是由于其增加hCSPα的活性。类似的依赖性 cln4 上cspα表型重量在初级成纤维细胞增加的水平被共表达重量cspα随着cspα-l115r,增加低聚物的水平和溶酶体溶酶体示踪剂cspα信号(后观察CSPα缺陷小鼠的贝尼特斯和金沙,2017年)。

澳门新葡亰平台游戏app下载 cln4 飞行模式不能被归类基因以明确的方式的表型。这些表型包括改变水平DCSP对单体和突触水平的影响 cln4 澳门新葡亰平台游戏app下载

功能突变的由L115和L116引起的增益的主要影响是未知的。然而,飞模型显示在齐聚hCSPα突变,在核内体积累,杀伤力程度的相关性。因此,现在看来,可能是 cln4 主要由突变加剧了CS域的已知的二聚特性(驱动hCSPα的过度低聚徐等人,2010)。这样的效果将解释可能过度错误折叠的低聚物prelysosomal入通路和突变hcspα的突触耗尽的路由。含有核内体hCSPα累积突变体容器的受损处理是随后可能错误折叠的低聚物的副效应。

对功能的影响增益另一种可能性从晚期内的非常规分泌途径hCSPs的最近描述的角色出现时,称为蛋白质错误折叠相关的分泌(图)(Xu等的。,2018)。即使是在地图不清楚是否神经hcspα参与,功能加剧的增益退出高尔基后的效果能hcspα晚期内贩卖到地图。一起,过度的内涵体和低聚到突变体hCSPα的路由可能会损害膜运输途径然后晚期内涵体需要象溶酶体途径和地图。

关键的依赖 cln4 澳门新葡亰平台游戏app下载 cln4 hCSPα突变,ITS齐聚和胞内积累。这些调节效应是由单个活动驱动要么HSC70本身,或由适量/ HSC70复合物的增效活性。这些活动既没有必然定位于SVS。在支持后者,共表达HA标签hsc70-4共定位的积累与中 cln4 上内涵体突变体hCSPα,这可能会干扰涂覆格蛋白的解离锚定由ESCRT组分小时(raiborg等的。,2001B)。可替代地,各活动HSC70可以关联随着内体microautophagy(澳门新葡亰平台游戏app下载 ; Uytterhoeven等人的,2015年)或错误折叠胞质非常规的蛋白质的分泌(Xu等的。,2018)。至少对于ESTA飞行模式,HSC70相关的分子伴侣介导的自噬随着活动(考希克和乌鸦,2012)可由于临界溶酶体转运排除灯-2是在果蝇中不存在(Uytterhoeven等人的,2015年)。

结束语

澳门新葡亰平台游戏app下载 cln4 飞模型,发现了一些新的见解,并进入病理重要的 cln4,最值得注意的是,遗传意想不到的特性 cln4 突变,hCSPα,一般缺陷泛素化,并prelysosomal加工缺陷的突变体错位。重点修改或HSC70 wt的QS水平的调节作用 cln4 表型提供的过早杀伤力之间存在强相关 cln4 突变果蝇,齐聚和prelysosomal内涵体突变hCSPα的积累。因此,神经毒性 cln4 hcspα突变体可以部分至少由于泛素化hCSPα低聚物的形成即然后,逐渐地积聚在prelysosomal内涵体和溶酶体干涉他们处理用于融合和逆行轴突其潜在的投放。

机制的基本病理 cln4 似乎是从其他NCLS其他大多数,其中在基因通常功能突变的损失是由于中介溶酶体不同之处在于功能,ER-溶酶体运输,或蛋白脂化(监狱Trullols等的,2015年; Cooper等的,2015年; Cotman等人的,2013; 摩尔和Cotman,2015年; 瓦里亚等人的,2013)。作为这样,底层病理机制 cln4 出现类似的那些“​​经典的”神经变性疾病由也就是说渐进积聚蛋白低聚物/聚集体被诱导,导致蛋白的体内平衡和/或溶酶体途径的随后的故障(阿布拉莫夫等人的,2009; Labbadia和森本,2015年; 兰斯伯里和Lashuel,2006年; Muchowski和瓦克,2005年; Neefjes和van der康德2014)。而我们才刚刚开始了解的复杂性 cln4,苍蝇模型为今后的工作中来剖析机制分析病理的有价值的工具 cln4.

材料和方法

关键资源表
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参考
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信息
基因(果蝇)CSPflybaseflyb:fbgn0004179澳门新葡亰平台游戏app下载
基因(人)dnajc5NCBIgeneid:80331编码CSPα
成绩单(果蝇)DCSP-2 / QS-PCNCBI基因库nm_168950.4使用的参考序列为DCSP构建体的合成,ORF:186-872
重组DNA试剂GDDP,UASC澳门新葡亰平台游戏app下载 rrid:addgene_35200PhiC31 attB位10xuas站点特定载体重组的插入
重组DNA试剂的pUC57-直流正接2.wt金斯瑞; ESTA纸全长野生型直流正接2 ORF随着克隆到pUC57中限制Kozak序列和NotI / KpnI位点
重组DNA试剂的pUC57-直流正接2.v117r金斯瑞; ESTA纸随着v117r突变如上
重组DNA试剂的pUC57-直流正接2.i118δ金斯瑞; ESTA纸随着i118δ突变如上
重组DNA试剂的pGEX-kg_rCSPα张和Ch和ra 2014野生型鼠cDNA序列CSPαv112f随着赛点突变对人类氨基酸序列
重组DNA试剂的pGEX-kg_hCSPα.l115r张和Ch和ra 2014随着l115r突变如上
重组DNA试剂的pGEX-kg_hCSPα.l116δ张和Ch和ra 2014随着l116δ突变如上
重组DNA试剂GDDP-uasc_CSPα.wt这项研究ORF编码全长野生型大鼠/人CSPα克隆到载体转化GDDP-UASC
重组DNA试剂GDDP-uasc_CSPα.l115r这项研究随着l115r突变如上
重组DNA试剂GDDP-uasc_CSPα.l116δ这项研究随着l116δ突变如上
重组DNA试剂GDDP-uasc_直流正接2.wt这项研究编码ORF克隆到载体转化GDDP-UASC全长野生型直流正接2
重组DNA试剂GDDP-uasc_直流正接2.v117r这项研究随着v117r突变如上
重组DNA试剂GDDP-uasc_直流正接2.i118δ这项研究随着i118δ突变如上
基于测序试剂RCSP对的NotI西格玛5'-gagcggccgccaaaatggctgaccagaggcagcgctc-3'
sequenced-
基于试剂
RCSP的KpnI转西格玛5'-catggtaccttagttgaacccgtcggtgtgatagctgg-3'
遗传试剂(d。果蝇)W [1118]加州理工学院的集合:西摩·本泽,加州理工学院flyb:fbal0018186基因型:W [1118]; isogenized遗传背景
基因试剂
(d。果蝇)
ELAV :: GAL4 [C155]布卢明顿果蝇股票中心flyb:fbst0000458; rrid:bdsc_458基因型:P {W [+ mw.hs] = gawb} ELAV [C155]
基因试剂
(d。果蝇)
nsyb :: GAL4雨果•贝伦,贝勒医学院flyb:fbst0051635; rrid:bdsc_51635基因型:和[1] W [*]; p {W [+ M *] = nsyb-gal4.s} 3
遗传试剂(d。果蝇)GMR :: GAL4布卢明顿果蝇股票中心flyb:fbst0001104; rrid:bdsc_1104基因型:W [*]; p {W [+ MC] = GAL4 n在ae.gmr} 12
遗传试剂(d。果蝇)澳门新葡亰平台游戏app下载 布卢明顿果蝇股票中心flyb:fbst0006921; rrid:bdsc_6921基因型:W [*]; p {W [+ MC] 2} = UAS nsyb.egfp
遗传试剂(d。果蝇)UAS :: GFP-MYC-2xfyve布卢明顿果蝇股票中心flyb:fbst0042712; rrid:bdsc_42712基因型:W [*]; p {W [+ MC] = UAS-GFP-MYC-2xfyve} 2
遗传试剂(d。果蝇)澳门新葡亰平台游戏app下载 布卢明顿果蝇股票中心flyb:fbst0035710; rrid:bdsc_35710基因型:和[1] SC [*] V [1] SEV [21]; p {并[+ t7.7】V [+ t1.8] = trip.glv21075} attP2位
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遗传试剂(d。果蝇)UAS-GFP :: hlamp1布卢明顿果蝇股票中心flyb:fbti0150347;
rrid:bdsc_42714
基因型:W [*]; p {W [+ MC] = UAS-GFP-灯} 2; p {W [+ M *] = nsyb-gal4.s} 3 /吨(2; 3)TSTL,CYO:TM6B,TB [1]
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遗传试剂(d。果蝇)UAS :: GFP-LC3(的Atg8)布卢明顿果蝇股票中心flyb:fbst0008730; rrid:bdsc_8730基因型:W [*]; p {W [+ MC] = UASP-EGFP-hulc3} 1; p {W [+ MC] = GAL4 :: VP16-nos.utr} cg6325 [MVD1]
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遗传试剂(d。果蝇)attP位-22A布卢明顿果蝇股票中心flyb:fbst0024481; rrid:澳门新葡亰平台游戏app下载 基因型:和[1]米} {vas-在t.dm ZH-2a的瓦特[*];米{3XP3-rfp.attp“} ZH-22A PhiC31插入背景,所有线上产生异型杂交到W [1118]
遗传试剂(d。果蝇)UAS ::金星rab7.wtřHis在ger(自由大学,柏林,德国); 樱桃等人,2013flyb:fbal0294208
遗传试剂(d。果蝇)hsc70-4 [δ356]布朗克等人的,2001flyb:fbal0124174澳门新葡亰平台游戏app下载
遗传试剂(d。果蝇)UAS :: hsc70-4卡伦PALTER,天普大学; 澳门新葡亰平台游戏app下载 ,flyb:fbst0005846; rrid:澳门新葡亰平台游戏app下载 基因型:W [126]; p {W [+ MC] = UAS-hsc70-4.wt} b
遗传试剂(d。果蝇)UAS:HA-hsc70-4.wtp Verstreken; Uytterhoeven等人的,2015年flyb:fbal0318413基因型:W [1118]; p {W [+ MC] = UAS-hsc70-4.ha}
遗传试剂(d。果蝇)澳门新葡亰平台游戏app下载 布卢明顿果蝇股票中心flyb:fbst0051997; rrid:bdsc_51997基因型:和[1] W [*]; p {W [+ MC] = UAS-snap25.l} 9
遗传试剂(d。果蝇)UAS :: SNAP25 KD布卢明顿果蝇股票中心flyb:fbst0027306; rrid:bdsc_27306基因型:和[1] V [1]; p {并[+ t7.7】V [+ t1.8] = trip.jf02615} attP2位
遗传试剂(d。果蝇)适量[R1]z在smaier等的,1994flyb:fbst0032035; rrid:澳门新葡亰平台游戏app下载 基因型:W [1118];适量[X1] / tm6tb [1] SB [1]; CSP的部分缺失(基因为null)
遗传试剂(d。果蝇)适量[X1]z在smaier等的,1994flyb:fbst0051998; rrid:bdsc_51998;基因型:W [1118];适量[R1] / tm6tb [1] SB [1];适量,基因的完全缺失,保持在实验室ESTA
遗传试剂(d。果蝇)澳门新葡亰平台游戏app下载 这项研究基因型:W [1118]; M {UAS-直流正接2} ZH-22A
遗传试剂(d。果蝇)UAS :: 直流正接2.v117r这项研究基因型:W [1118]; M {UAS-直流正接2.v117r} ZH-22A
遗传试剂(d。果蝇)UAS ::直流正接2.i118δ这项研究基因型:W [1118]; M {UAS-直流正接2.i118δ} ZH-22A
遗传试剂(d。果蝇)UAS ::hCSPα这项研究基因型:W [1118]; M {UAS-hCSPα} ZH-22A
遗传试剂(d。果蝇)UAS ::hCSPα.l115r这项研究澳门新葡亰平台游戏app下载
遗传试剂(d。果蝇)UAS ::hCSPα.l116δ这项研究ν:W [1118]; M {UAS-hCSPα.l116r} ZH-22A
澳门新葡亰平台游戏app下载 抗CSPα(兔多克隆)恩佐生命科学猫#:VAP-sv003e; rrid:ab_2095057免疫染色(为1:2000);蛋白质印迹(WB,1:20000); IP(1:250)
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澳门新葡亰平台游戏app下载 抗兔IgG(H + L)HRP缀合的(山羊多克隆)赛默飞世尔科技猫#:a16096; rrid:ab_2534770WB(1:10000)
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软件,算法土砖 Photoshop的CC土砖rrid:scr_014199
软件,算法量的一种分析软件1-d伯乐rrid:scr_014280

果蝇 株和畜牧业

请求详细的协议

分别在23℃所有的苍蝇标准玉米面培养基上提出了与12/12的亮 - 暗循环,除非另有规定。 Gal4驱动子菌株nsyb-GAL4,ELAV-GAL4(C155)和GMR-GAL4和UAS菌株表达EGFP-nsyb,GFP-MYC-2xfyve,TSG101 KD,hlamp1-GFP,旋-MYC-EGFP,GFP-LC3(的Atg8 ),GFP-KDEL,nsyb-EGFP,YFP-Rab5的,RAB7-YFP,hsc70-4 KD(1-3),syx1a,SNAP25和SNAP25 KD从布卢明顿获得 果蝇 股票中心(BDSC,印第安纳州布卢明顿)。 UAS菌株表达金星RAB7(樱桃等人,2013),Hsc70-4(澳门新葡亰平台游戏app下载 ),并已-hsc70-4(Uytterhoeven等人的,2015年)来自P.R.获得Hies在ger(自由大学,柏林,德国)中,k。 PALTER(坦普尔大学,费城,PA)或p。 Verstreken(VIB疾控中心的生物,比利时鲁汶)分别。该 CSP (R1,X1)和 hsc70-4 (Δ356)基因缺失等位基因先前由美国产生的(布朗克等人的,2001; z在smaier等的,1994)。

代转基因的UAS

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转基因,以产生表达人单独重量%,l115r-和GAL4 / UAS系统中的转录控制下l116δ突变CSPα(品牌和Perrimon,1993年),编码人野生型和突变CSPα改性大鼠cDNA的开放阅读框(张和Ch和ra 2014澳门新葡亰平台游戏app下载 果蝇 科扎克共有序列(5 'gagcggccgccaaaatggctgaccagaggcagcgctc 3'澳门新葡亰平台游戏app下载 5 'catggtaccttagttgaacccgtcggtgt gatagctgg 3'澳门新葡亰平台游戏app下载 澳门新葡亰平台游戏app下载 )。的cDNA编码重量和 cln4 分别DCSP突变从头合成(金斯瑞,新泽西州皮斯卡塔韦)使用编码CSP2的开放阅读框的cDNA序列(QS-PC,accessionid:nm_168950.4))作为模板(聂等人的,1999)。突变v117r和i118δ引入直流正接2产生 cln4 DCSP突变体。无论v117r和i118δ类似于人类 cln4 l115r和l116δ突变,分别。在合成的cDNA含有一个NotI位点,随后在5“端和3在终止密码子之后的Kpn1位点”末端Kozak序列,并插入到pUC57中进行质粒。对于转基因表达,定向亚克隆的cDNA然后分别GDDP-UASC成使用NotI和KpnI位切割位点的载体。

但受到ΦC31整合产生的转基因动物(比朔夫等人,2007年)2号染色体上(2L中的转基因UAS入attP位点在部22a2中:1476459..1476459)。 GDDP-UASC-QS-X注入质粒分别 y1 M [vas-在t.dm] ZH-22A W *; M [3XP3-rfp.attp“] ZH-22A (BDSC#24481)的胚胎(彩虹转基因果蝇,卡马里奥,CA)。至少两个独立的重组菌株,获得用于每个转基因和出交叉交换非重组染色体。该 澳门新葡亰平台游戏app下载 盒通过loxP序列介导的重组除去如所描述的(比朔夫等人,2007年)。含有转基因的UAS菌株纯合出处成立于一个遗传背景重量代表控制(w1118)和 直流正接 缺失突变体(w1118; DCSPX1)。

对于单拷贝转基因表达杂交组合通过杂交雄性纯合制成 w1118,ELAV-GAL4 [C155] 到苍蝇纯合子 w1118; M [UAS :: CSP-X。] ZH-22A F1雌性果蝇产生雌性子代表达CSP-X(w1118,ELAV-GAL4 [C155] / w的1118; M [UAS :: CSP-X] ZH-22A / +)和含有一个无声(非表达)转基因雄性子代容器(w1118; M [UAS :: CSP-X] ZH-22A / +)。两个拷贝表达杂交组合通过杂交雌性制造 w1118,ELAV-GAL4 [C155]; M [UAS :: CSP-X] ZH-22A / CYO,肌动蛋白-GFP 男性 w1118; M [UAS :: CSP-X] ZH-22A。女性F1代杂合 ELAV 司机和纯合子转基因UAS(w1118, ELAV-GAL4 [C155] / w的1118; M [UAS :: CSP-X} ZH-22A)被选择用于分析。

DCSP空救援

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利用所有遗传救援实验 CSP - / - 空缺失或遗传背景表达重量 cln4 hCSPα从单个转基因突变体。女性 w1118,ELAV-GAL4 [C155]; QSR1/ TM6 TB SB 澳门新葡亰平台游戏app下载 w1118; M [UAS :: HCSP-X] ZH-22A; QSX1/ TM6 TB SB 或外邪 w1118; QSX1/ TM6 TB SB 罪恶的控制。在23只苍蝇℃下引发。男性后代(w1118,ELAV-GAL4 [C155]; M [UAS :: HCSP] ZH-22A / +; QSX1 / R1澳门新葡亰平台游戏app下载

生存和成人寿命

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使用下列方案渡:用于表达单拷贝,半合子 w1118,ELAV-GAL4 [C155] 被邪恶冲过纯合子 w1118; UAS :: QS-X 女性产生非表达F1外邪控制(w1118; UAS :: CSP-X / +)和QS F1表达女性(w1118,ELAV-GAL4 [C155] / w的1118; UAS :: CSP-X / +)。两个拷贝表达,半合子 w1118澳门新葡亰平台游戏app下载 被邪恶冲过纯合子 w1118; UAS :: QS-X 澳门新葡亰平台游戏app下载 w1118; UAS :: QS-X)和QS F1表达女性(w1118,ELAV-GAL4 [C155] / w的1118; UAS :: QS)。分别在23℃或28℃升高苍蝇。活力通过得分男性和女性新鲜封闭蝇的比例确定为。成人的寿命是由单独的小瓶培养新鲜封闭的男性和女性每天或每2天得分死苍蝇决心。转移成蝇每周新鲜的食物。

免疫染色

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流浪3RD 龄幼虫进行解剖在SYLGARD-包被的培养皿容器含有冷CA2+ 澳门新葡亰平台游戏app下载 2,10的NaHCO35海藻糖,蔗糖115,5个HEPES,pH 7.2)中。解剖幼虫固定在4%甲醛溶液20(VNC)或45分钟(NMJs)(电子显微镜科学,哈特菲尔德,宾夕法尼亚州)在磷酸盐缓冲盐水(PBS),在室温下pH为7.3(RT)。 PBS补充有0.2%的Triton X-100(PBST)(pH为7.3)用于幼虫NMJs的免疫染色而添加了0.4%的Triton X-100用于幼虫VncS的免疫染色PBS(pH 7.3)中。洗涤后在室温下在PBST 10分钟3次,幼虫孵育在4℃下过夜用PBST稀释的初级抗体,在室温下15分钟洗涤3次,温育在室温或过夜在PBST中稀释的2小时的二级抗体4℃下,最后洗涤3次,在室温15分钟用PBST。是当天获得的共聚焦图像,否则后固定制剂。

下面的抗体和稀释液使用兔抗CSPα,1:2000(恩佐生命科学猫#VAP-sv003e,rrid:ab_2095057);小鼠抗直流正接,1:250(DSHB目录号DCSP-1(ab49),rrid:ab_2307345; z在smaier等的,1990);小鼠抗GFP,1:1000(DSHB目录号DSHB-GFP-12a6上,rrid:ab_2617417);豚鼠抗小时,1:2000; (Lloyd等的,2002),H。贝伦,医学院贝勒,休斯顿,德克萨斯州);大鼠抗公顷,1:200(澳门新葡亰平台游戏app下载 目录#3F10,rrid:ab_2314622澳门新葡亰平台游戏app下载 ab_2115328);羊抗golgin245,1:2000(DSHB猫#golg在245,rrid:ab_2618260),山羊抗GMAP,1:2000(DSHB猫#GMAP,rrid:ab_2618259);小鼠抗RAB7,1:100(DSHB目录号RAB7,rrid:ab_2722471; 里德尔等的。,2016);小鼠抗syx1a,1:200(DSHB猫#8C3,rrid:ab_528484);小鼠抗泛素 - 缀合的蛋白质,1:2000(恩佐生命科学目录号BML-pw8810,rrid:ab_10541840澳门新葡亰平台游戏app下载 ab_2338967);山羊抗小鼠Alexa氟488-IgG1的缀合,1:500(赛默飞世尔科技目录号A-21121,rrid:ab_2535764);驴抗兔IgG(H + L)的Cy3缀合的,1:500(杰克逊免疫实验室目录#711-165-152,rrid:ab_2307443);山羊抗豚鼠IgG(H + L)的Alexa Fluor488的共轭的,1:1000(赛默飞世尔科技目录号A-11073,rrid:ab_2534117);山羊抗大鼠IgG(H + L)的Alexa Fluor488的共轭的,1:500(杰克逊免疫实验室目录#112-545-167,rrid:ab_2338362)。

共焦成像

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染色制剂进行成像使用装备有共焦激光扫描仪的Olympus显微镜BX50WI(Fluoview共300),60倍的水浸泡的目的(lumplfl; NA,0.9),多氩气(630),绿色氦氖(430),和吩网络(630)的激光。在光轴垂直切片用0.8微米(NMJs)或1.5微米(VNC),用于使用Fluoview共软件光学切片间隔获取。分析使用ImageJ软件(V1.50斐济,美国国立卫生研究院)的离线图像。

用于控制和突变体幼虫荧光信号的量化进行解剖以相同的培养皿这种固定和那名相同地执行抗体孵育。进行成像,在相同的激光设置所有样本。每单位面积的荧光强度,从关注区域(ROI)的通过使用图像处理软件Ĵ包围单个突触终扣的区域确定为。

在VNC积累的量化QS,产生Z-最大强度随着光部的突起和裁剪到规定的60×80×45微米的体积(216000微米3)。这些图像栈代表半A4和A5段的背大部分。阈值化背景扣除后,得出的ROI周围的所有可见是CSP阳性punctae;对于那些出现在多个光学切片仅使用部分提供最亮信号。投资回报率的区域被编译到累计面积比较基因型频率。

Western blot分析

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是大脑从幼虫徘徊解剖3RD 龄幼虫在磷酸盐缓冲盐水(PBS,pH 7.3)中和五个脑转移到60微升缓冲液(2%SDS,10%甘油,60毫摩尔Tris pH值6.8,0.005%溴酚蓝和100mM DTT)。是大脑用枪头P200均化,煮沸5分钟,并以2000g离心3分钟。可溶性级分转移到新的管中,煮沸1分钟,并等效〜1.5的装载到大脑立即10%丙烯酰胺凝胶进行SDS-PAGE在80V(微型千变万化细胞,BioRad公司,赫拉克勒斯,CA)。在20 V分离的蛋白质在硝化纤维素印迹膜用于使用IBLOT系统(Invitrogen,卡尔斯巴德,CA)6分钟。转移后,将印迹封端使用1%牛血清白蛋白级分V(#bp1600-100,Fisher Scientific公司)的PBS加味30分钟用0.2%吐温20,pH值7.3(PBSTw)。是在印迹与一抗4℃,洗涤温育过夜,并在4℃温育用HRP偶联的第二抗体2小时。为了标准化为蛋白上样,剥离印迹(#21059;赛默飞Scientific)中在室温下15分钟,并进行免疫染色为β微管蛋白。分别印迹使用伯乐试剂盒ECL西部清晰度和ChemiDoc XRS成像系统成像。通过光密度测定分析随着软件数量一(BIO-RAD)进行定量条带强度的蛋白质。进行原始强度值归一化为β微管蛋白作为上样表达的对照的测量和n倍以改变基因型的适当控制。稀释抗体PBSTw和下列浓度使用:兔抗CSPα1:20,000(恩佐生命科学猫#VAP-sv003e,rrid:ab_2095057澳门新葡亰平台游戏app下载 ab_2307345; z在smaier等的,1990);小鼠抗泛素 - 缀合的蛋白质,1:2000(恩佐生命科学目录号BML-pw8810,rrid:ab_10541840澳门新葡亰平台游戏app下载 ab_528499);山羊抗小鼠IgG HRP共轭的,1:5000(该rmo Scientific的#32430猫,rrid:ab_1185566;山羊抗兔IgG(H + L)HRP缀合的1:10,000(赛默飞世尔科技猫#a16096,rrid:ab_2534770)。

羟胺处理

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使用在2%SDS,100mM的DTT,60毫摩尔Tris pH值6.8中匀浆成人头,然后将处理过的用0.5M的羟胺pH为7.0或0.5的1M Tris pH值7.0(终浓度)在室温下24小时,稀释之前的3倍1X Laemmli缓冲液。煮沸使用用于SDS-PAGE前5分钟的样品。

免疫

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年轻的成年蝇(1-3天后羽化)的闪光灯在液氮中冷冻2 澳门新葡亰平台游戏app下载 2。约的头100微升匀浆在500微升缓冲液含有IP容器1%的Triton X-100和30mM的Tris-HCl(pH值7.2),150mM的氯化钾,0.5毫摩尔MgCl2。物在22.000反复离心以除去不溶性碎片匀浆。将澄清的上清液在1用兔抗CSPα孵育:200(FC)在4℃下在旋转器上1个小时,然后一个孵育50微升蛋白A / G加琼脂糖(#SC-2003,圣生物技术交叉,德克萨斯州达拉斯)在4℃下2小时。分别以2000g离心下来用台式离心机琼脂糖珠,除去并储存上清液。被珠与IP缓冲液再悬浮和离心重复洗涤4次。将细胞再悬浮在Laemmli珠最后缓冲器,煮沸5分钟,离心2分钟,并转移至新的试管中用于SDS-PAGE。

电子显微镜

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幼虫快速解剖在4%PFA再固定剂新鲜在容器中固定过夜含有:3%戊二醛,1.5%甲醛,2毫米氯化钙2,0.1M二甲胂酸钠,pH为7.3。分别被固定,用2%的OsO 4 2小时之前在二甲砷酸0.1米漂洗样品。接着,样品用HPLC等级H2或是以串联阶梯乙醇(30%,50%,70%,90%,95%,100%)脱水之前然后用100%丙酮。组织渗透有Durcupan ACM塑料半嵌入(#14040,电子显微镜科学,哈特菲尔德,宾夕法尼亚州)通过渐进混合物用丙酮(25%,50%,75%,100%),在60℃下固化,修整并分段随着钻石刀(70纳米)。分别用4%乙酸双氧铀和柠檬酸铅poststa在ed部分。获得具有一个xr80m-B AMT AMT相机上运行的软件在JEOL 1200EX图像。出版,编译的和制备的数字分别为与Photoshop CC(土坯)。对比度和图像的强度最低限度地调整。根据需要进行裁剪的图像。

眼表型的量化

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这是由本质上别人了一些修改的描述进行分析(papanikolopoulou和skoulakis,2011; 圣诞老人-玛利亚等的,2015年)。简单地说,1-2日龄成人眼表型使用立体显微镜数字成像。半定量评估表型连续通过编码由幼稚一些研究人员获得的图像和盲目得分达到。每只眼睛被卸鉴于比较分数得分的相对粗糙度与已知的类:(1)正常WT-像眼睛。 (2)略微“粗”眼睛表面,轻微DIS-着色,和/或减少眼睛尺寸最小。 (3)粗眼表面,显著DIS-着色,小眼杂乱无章,和/或尺寸减小。 (4)粗糙眼表面;组织,畸形和融合的小眼的损失;更明显的尺寸红眼。 (5)眼睛粗糙表面,组织的最显着的损失,和/或在眼MOST尺寸显着减小。收集分数每基因型至少八个单苍蝇。

数据和统计分析

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澳门新葡亰平台游戏app下载 t test, Mann-Whitney, or one-way ANOVA (Kruskal-Wallis for non-parametric data) test with appropriate post-hoc tests using 棱镜 software)。 P values < 0.05,<0.01, 和 <0.001 are indicated 在 graphs with one, two和 three asterisks, respectively.

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决定书

  1. 读升鲁宾
    回顾编辑;哈佛大学干细胞研究所,哈佛大学,美国
  2. 迈克尔·b艾森
    高级编辑;加州大学伯克利分校,美国HHMI大学

在透明度,澳门赌场网站,包括社论决定书,并附带作者响应。同行审查后发送给作者的信件的轻编辑版本中示出,表示最实质性关注;未成年人的意见通常不包括在内。

验收总结:

的神经元蜡样lipofusc在oses,其中最有名的是Batten病,是神经障碍,往往在溶酶体贮积涉及缺陷的遗传异质性基团。在本文中,作者重点 cln4,A不太很好理解的,常染色体显性遗传,通过形式中的突变基因的突触小泡蛋白cspα引发的疾病。要了解突变基因可以导致怎样的缺陷,中枢神经系统发育,作者表达的突变体相关有了CSPα cln4果蝇 神经元并用各种方法来研究的后果。表明作者,而不是副随着突触小泡,突变蛋白形成功能性聚集状包体异常。因此,出现表型的疾病与错位,也许,凝集相关主导增益的毒性作用造成的。感兴趣的神经系统疾病,以及学习那些渴望学习如何利用模式生物的人类疾病的科学首页,将受益于阅读这大大纸。

经过同行评议的信决定:

感谢您的文章提交“到 果蝇 神经元蜡样脂褐质的模型 cln4 hypermorphic揭示了通过作用机制的增益“审议 澳门赌场网站。您的文章,由二审稿审议,并evaluation've通过审查编辑和迈克尔·艾森的高级编辑去过监督。该评论者的选择保持匿名。

评论首页都彼此讨论的回顾和检讨编辑起草这一决定,以帮助您准备一份修改稿。

摘要:

使用提出的工作 果蝇 澳门新葡亰平台游戏app下载 cln4通过在CSPα突变,突触小泡相关蛋白引起的。要做到这一点,他们用表达人的经典方法 cln4 然后,在突变体果蝇开发仔细分析对神经元和轴突的影响。它们提供了令人信服的证据表明突变体蛋白寡聚和主导本质的神经元功能的“有毒功能获得”最终损害。

二审稿在本文中疾病建模双方的专业知识。然而,使用非常不同的系统他们:一个是专注于使用从其他生产的人iPSC的神经元是鉴于主要是一个 果蝇 生物学首页。都提供了类似的积极评价关于价值和ESTA纸的质量及其提供更深入的了解一个罕见而复杂的神经退行性疾病的有用性。还兼有提供改进建议目前的手稿也比较像。执行他们11个实验表明,本文应在发布的 澳门赌场网站.

必要的修改:

1)总体而言,作者在突变表型报告一组主要下游的 cln4 模型,包括UBI-hcspα低聚物,受损的蛋白质稳态,减少突触hcspα水平和prelysosomal内涵体的积累。然而,所有不是表型是随着在标题和摘要强调功能(GOF)机构的增益一致 - 突变体的hCSPα特定障定位(减少突触水平可能是由于寡聚化/多泛素化/重路由)和总水平增加泛素化的蛋白质的(可能是由于降低的QS / HSC70活性)。如果它是未知如何将这些表型对比过度齐聚和膜运输导致疾病,这个话题值得更加清晰。该数据目前呈现的方式,这是很难的点连接上的所有关联的不同突变表型 cln4,而这将有助于为作者添加额外的讨论/取景围绕什么,这些不同表型可能意味着,它们如何相互关联,以及他们如何可能涉及到的疾病。

2)在讨论中,一些点是言过其实的,应予以调整。特别是在第“表型的剂量依赖性 果蝇cln4 模型”,作者声称他们‘显性遗传模式’。他们不这样做,他们已经控制基因的剂量,因为他们在未来的正确线路状态。他们在比较结果不寻常 cln4 案例研究中,却看不到我怎么ESTA支持或反驳比较“剂量依赖性积聚”病理。他们并没有进行试验的 果蝇 可能发生的毒性建立无脑的神经退行性病变或功能性破坏。我会删除此声明。

3)不减少内源性水平DCSP对突触hcspα任何影响降低总体水平或泛素化蛋白的水平增加了吗?类似地,如果对prelysosomal内涵体(图8I)积累HSC70有助于共伴侣活性,并HSC70蛋白稳态此外冲击hCSPα或损失减少突触水平?

澳门新葡亰平台游戏app下载 澳门新葡亰平台游戏app下载 在上下文HCSP的半胱氨酸串域的突变体 cln4 突变(见十ARDanuy等的,2017年)没有毒性。

5)在整个手稿中,作者操纵HCSP和直流正接在各种实验(例如毒性的试验模型)。它因此小心地用直流正接HCSP的功能进行比较来说明的关键。特别是在图1D的作者应该添加为dcsp2重量UAS控制。作者利用神经ELAV-GAL4驱动程序来表达HCSP转基因。这是很难用ESTA ESTA司机没有比较有效的评估HCSP如何解救重量DCSP突变体。类似地,图4图2补充的作者应该为v117r和i118ΔdCSP2 HCSP的ELAV-GAL4驱动的表达增加寿命试验作为比较,以加强其过表达突变体与突变直流正接2结论作用类似于突变HCSP。作者已经把所有这些实验的必要储备。

6)有用的筛选测定法中,对于特别“毒性蛋白”在 果蝇 澳门新葡亰平台游戏app下载

重量HCSP 7)的作者说,脂化水平“大约0.8 -1.5倍的内源性直流正接”。考虑到他们的其他数据图的准确性2解释为什么他们可以范围是如此之大?如果必要的话应该是ESTA反复实验,提高HCSP的脂化的直流正接来比较。

//doi.org/10.7554/elife.46607.018

笔者响应

必要的修改:

澳门新葡亰平台游戏app下载 α 低聚物,受损的蛋白质稳态,减少突触HCSPα 澳门新葡亰平台游戏app下载 α (推测是由于减少的突触水平,以寡聚化/多泛素化/重路由)和总增加泛素化蛋白的水平(可能是由于降低的QS / HSC70活性)。如果它是未知如何将这些表型对比过度齐聚和膜运输导致疾病,这个话题值得更加清晰。该数据目前呈现的方式,这是很难的点连接了所有在突变cln4相关联的不同表型的,这将是有帮助的作者添加各地的更多讨论/成帧什么这些不同表型可能意味着,他们怎么可能之间的相互关系,以及它们如何可能与疾病。

响应审阅者的建议,我们修改讨论的部分路段,以更好地描述观察表型跟对方的关系可能。

此外,我们修改了讨论克利里描述了支持这一概念的表型 cln4 主要突变引起的功能表型的hypermorphic增益。还描述ESTAsección不适合的表型到这一点这种分类(小标题“cln4 等位基因遗传相似功能的突变hypermorphic增益“)。 ESTA包括用于将初级潜在hypermorphic的影响2点建议 cln4 突变。具体来说,我们建议对导致过度齐聚和在地图上晚期内为hcspα的贩运潜在影响二聚性不论hCSPα的潜在影响。

2)在讨论中,一些点是言过其实的,应予以调整。特别是在第“表型的剂量依赖性 果蝇 cln4模型”,作者声称他们‘显性遗传模式’。他们不这样做,他们已经控制基因的剂量,因为他们在未来的正确线路状态。

难道我们同意并改写句子如下:“为了评估的剂量依赖性 cln4 在飞行模式的表型,我们控制的转基因表达的基因剂量 cln4 通过neuronally表达突变无论单或双突变体的转基因以两种内源性基因拷贝的存在重量DCSP”hCSPα。

他们在比较结果cln4一个不寻常的案例研究,但我没有看到ESTA支持或反驳相比如何“剂量依赖性积聚”病理。他们并没有进行试验的 果蝇 可能发生的毒性建立无脑的神经退行性病变或功能性破坏。我会删除此声明。

我们是否同意,除去这种情况下,研究任何引用。

3)直流正接不减少内源性水平对突触减少HCSP任何影响α 或泛素化蛋白的整体水平提高水平?类似地,如果HSC70有助于上prelysosomal内涵体(图8I)积累共伴侣活性,确实的蛋白质HSC70当前冲击损失或降低的突触稳态HCSPα 水平?

我们有必要的实验进行回答问题,并发现这些DCSP降低泛素化蛋白的显着水平降低的水平幼虫大脑(图8C)。出乎意料的是,降低了直流正接增强水平在幼虫NMJs已经HCSP-L115和-l116减少突触蛋白水平(图8D)。

4)这将是一个非常强大的除了支持低聚仿佛作者能证明C(4-7的表达毒性机制),以在cln4突变的上下文中HCSP的半胱氨酸串域的突变体(参见迭-ARDanuy等的。,2017)是无毒的。

这虽然我们同意齐聚进一步的证据支持的机制将是有毒的一个强大的除了我们的研究中,我们并没有追求两个主要推荐理由实验。首先,即使是乐观的估计,用于生成和分析这些 cln4 / C(4-7)至 澳门新葡亰平台游戏app下载

此外,仔细考虑了实验要求的冲击后,它可能无法为有毒机制齐聚较强的支撑证据提供给我们因为只包含容器CSPα 澳门新葡亰平台游戏app下载 突变仅微弱随着膜(油渣和张伯伦,2006年)有关。一致的是, 澳门新葡亰平台游戏app下载 减少单独留在CSPα渲染胞浆蛋白的大块部分(十ARDanuy等的,2017年油渣和张伯伦,2006年)的CS域的半胱氨酸的棕榈酰化的整体效率。 澳门新葡亰平台游戏app下载 cln4 也表现出突变体hcspα效率降低棕榈酰化等以重量CSPα(十ARDanuy,2017#5899)。因此,聚集的损失 cln4 / C(4-7)至 双突变体可能已经降低到由于膜结合而不是C(4/7)的区域在聚集过程的特定角色。这个地址十ARDanuy等的。检查 澳门新葡亰平台游戏app下载 双突变体由于第l换人保持CSPα的膜协会(但不是棕榈酰化,在ER逮捕贩卖)。因为蛋白质聚集 cln4 CSPα突变体是由抑制 澳门新葡亰平台游戏app下载 突变十ARDanuy等的。结论是,在CS域的C(4-7)区域是居中聚集过程。

相应地,使用的 cln4 含双突变体 澳门新葡亰平台游戏app下载 和/或 澳门新葡亰平台游戏app下载 澳门新葡亰平台游戏app下载 cln4 CSPα突变体蝇模型中的毒性是许多原因的问题:(1)由于 cln4 / C(4-7)至 有效地不棕榈酰化和大分数在PC12细胞胞质,在神经元中的双重突变蛋白质的表达可能已经飞样作用。因此,毒性由于电位衰减可能是预期这两种低聚的损失或减小到蛋白的SVP或SVS的膜关联。 (2)使用 澳门新葡亰平台游戏app下载 在加双突变体是不可能解决问题的ESTA ITS因为贩运在ER被捕(十ARDanuy等的,2017年油渣和张伯伦,2006年)。因此,毒性由于电位衰减可以既是低聚或蛋白的SVP或SVS的减小关联的预期损失。可替代地,CSPα的预期差随着仅错位 澳门新葡亰平台游戏app下载 和/或 澳门新葡亰平台游戏app下载 可以通过本身引起毒性反应的显著程度有不同的起源比的 cln4 突变。如果是的话,会严重限制ESTA结论对于毒性的双突变体获得。这很可能是在飞行情况突变由于DCSP覆盖C(4-7)地区占主导地位的影响表现出严重的影响危及生存(阿诺德,2004#3616)。

5)在整个手稿中,作者操纵HCSP和直流正接在各种实验(例如毒性的试验模型)。它因此小心地用直流正接HCSP的功能进行比较来说明的关键。特别是在图1D的作者应该添加为直流正接2重量UAS控制。作者利用神经ELAV-GAL4驱动程序来表达HCSP转基因。这是很难用ESTA ESTA司机没有比较有效的评估HCSP如何解救重量DCSP突变体。

难道我们同意并执行的请求救援 CSP 缺失突变体具有重量直流正接2转基因,和添加的数据为具有图1D。

类似地,图4图2补充的作者应该为v117r和i118ΔdCSP2 HCSP的ELAV-GAL4驱动的表达增加寿命试验作为比较,以加强其过表达突变体与突变直流正接2结论作用类似于突变HCSP。作者已经把所有这些实验的必要储备。

难道我们同意并执行请求的可行性分析。 直流正接2的单拷贝的表达,DCSP-v117-i118δ或在开发过程中,在23℃(未示出)和27℃(图4位数的补充1A)上存活ADH没有影响。在27ºC正常成人的寿命是存在(图4,图补充1D)。 2个拷贝表达减少动物的表达WT直流正接或直流正接-v117到类似程度(图4-图补充1b)的生存力的少数幸存成人重量DCSP和DCSP-v117动物显示粗糙的眼睛,异常膨胀的翅膀,受损的运动和死亡在一天之内。表达DCSP-I118永远成蝇观察(图4,图补充1B)。

6)有用的筛选测定法中,对于特别“毒性蛋白”在 果蝇 澳门新葡亰平台游戏app下载

难道我们同意并执行请求的眼表型的半定量评估。该数据示于图3c和9e和在各自的结果部分中讨论。评估是在材料和方法部分(小标题“眼表型的量化”)中说明。

重量HCSP 7)的作者说,脂化水平“大约0.8 -1.5倍的内源性直流正接”。考虑到他们的其他数据图的准确性2解释为什么他们可以范围是如此之大?如果必要的话应该是ESTA反复实验,提高HCSP的脂化的直流正接来比较。

数据是通过测量在Western印迹染色强度以纯化的重组梯hCSPα和直流正接的稀释获得。这些值正常化他们的输入电平,然后进行比较。在上述范围内,由于不同的值,获得当比较两个最接近为每个纯化的蛋白质种类带。观察到的实验范围可能是由于变化在这种情况下,将适当的平均数。然而,这可能是由于另外,由于大范围的用于梯子蛋白质输入非线性抗体/抗原相互作用。为解决这一问题,我们修改了实验,现在提供的平均值(0.98±0.23,分段“cln4 突变导致形成耐SDS的低聚物和泛素化蛋白质在神经元hCSPα”,第二段)代替最大范围的。

//doi.org/10.7554/elife.46607.019

文章和作者信息

作者详细信息

  1. 埃利奥特Imler

    1. 在神经科学研究生跨学科计划,亚利桑那,美国的大学
    2. 神经科学,亚利桑那大学图森,美国的系
    贡献
    概念化,形式化分析,调查,可视化,方法,写初稿,编写,审查和编辑
    利益争夺
    没有利益冲突的声明
  2. 劲唱pyon

    1. 神经科学,亚利桑那大学图森,美国的系
    2. 本科计划在神经科学和认知科学,分子生物学和亚利桑那州的图森,美国的蜂窝,大学部
    贡献
    调查
    利益争夺
    没有利益冲突的声明
  3. 澳门新葡亰平台游戏app下载

    1. 神经科学,亚利桑那大学图森,美国的系
    2. 本科计划在神经科学和认知科学,分子生物学和亚利桑那州的图森,美国的蜂窝,大学部
    贡献
    调查
    利益争夺
    没有利益冲突的声明
  4. meaghan Torvund

    1. 在神经科学研究生跨学科计划,亚利桑那,美国的大学
    2. 神经科学,亚利桑那大学图森,美国的系
    贡献
    调查
    利益争夺
    没有利益冲突的声明
  5. 永全张

    1. 神经科学,耶鲁大学,纽黑文,美国系
    2. 神经内科,耶鲁大学,纽黑文,美国系
    贡献
    资源,写作,审查和编辑
    利益争夺
    没有利益冲突的声明
  6. sreeganga钱德拉

    1. 神经科学,耶鲁大学,纽黑文,美国系
    2. 神经内科,耶鲁大学,纽黑文,美国系
    贡献
    概念化,资源,资金获取,写作,审查和编辑
    利益争夺
    没有利益冲突的声明
    ORCID icon 澳门新葡亰平台游戏app下载 0000-0001-9035-1733
  7. 康拉德·êz在smaier

    1. 神经科学,亚利桑那大学图森,美国的系
    2. 分子和细胞生物学系,亚利桑那,美国的大学
    贡献
    概念化,资源,数据策展形式分析,监督,资金获取,可视化,方法,写初稿,项目管理,编写,审查和编辑
    函授
    kez4@email.arizona.edu
    利益争夺
    没有利益冲突的声明
    ORCID icon 澳门新葡亰平台游戏app下载 0000-0002-9992-6238

资金

神经紊乱和中风研究所(r01ns083849)

  • sreeganga钱德拉

神经紊乱和中风研究所(r21ns094809)

  • 康拉德·êz在smaier

该资助者在研究设计,数据收集和解释,或提交作品出版的决定没有任何作用。

确认

澳门新葡亰平台游戏app下载

高级编辑

  1. 澳门新葡亰平台游戏app下载

编辑审查

  1. 李升鲁宾,哈佛干细胞研究所,哈佛大学,美国

出版历史

  1. 接收的:2019年3月6日
  2. 接受:2019年10月29日
  3. 接受稿件发表: 二○一九年十月三十〇日(版本1)
  4. 记录的版本发布: 2019年12月6日(第2版)

版权

©2019,imler等。

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